Мистерии сибирской язвы (учебник)

Раздел IV • 30. Экология B. thuringiensis

subsp. kurstaki и subsp. aizawai, чьи токсины активны в отношении личинок чешуекрылых насекомых, а также subsp. israelensis, выделенный в 1976 году из стоячего пруда в пустыне Негев (Израиль), чей токсин активен в отношении личинок различных видов комаров и мошек.

Последний подвид представляет особенный интерес, поскольку его параспоральное тело наиболее сложно устроено. Во время спорообразования на внешней поверхности споры формируется три белковых структуры, окружённых многослойным волокнистым матриксом, из которых два несут по одному белку (Cry11Aa1 и Cyt1Aa1), а третий – два белка (Cry4Aa1 и Cry4Ba1), причём белки Cry4Aa1, Cry4Ba1 и Cry11Aa1 являются кристаллическими, а белок Cyt1Aa1 – цитотоксическим. Затем структуры соединяются, формируя сферическое параспоральное тело, прикреплённое к базальному слою экзоспория. Матрикс, соединяющий структуры, имеет гексагональную структуру, с которой связываются белки Bt152, Bt148, Bt113, Bt073 и Bt075, причём белок Bt152 отвечает за процесс слияния структур, а Bt075, по-видимому, является капсулой, защищающей саму бактерию от цитотоксического действия Cyt1Aa1, и, как считается, происходит от главного капсидного белка какого-то бактериофага (вероятно ген, кодирующий Bt075, является профагом). Функция остальных белков пока не установлена.

Дальнейший механизм действия в целом схож у всех Bt-токсин- продуцирующих штаммов. Попав в среднюю кишку личинки, под действием щелочной среды параспоральное тело лизируется, высвобождая токсины, которые активируются пищеварительными ферментами, образуя поры в клеточной мембране клеток пищеварительного тракта (Рис. 30.2). В результате нарушается осмотический баланс, что приводит к лизису клетки. То есть в общем виде механизм действия очень похож на таковой у «диарейных» штаммов B. cereus ss. Лизис клеток приводит к скоплению жидкости в

Рис. 30.2. 3D-компьютерная томография (саггитальный срез) ► повреждений, возникающих у личинок жёлтолихорадочного комара (Aedes aegypti)

спустя час после заражения B. thuringiensis subsp. israelensis (b) в сравнении с контролем (а). Обратите внимание на образовавшиеся поперечные щели, указывающие на лизис клеток пищеварительного тракта (по Alba-Tercedor J., 2023)

400

Раздел IV • 30. Экология B. thuringiensis

теле личинки, создавая пустое пространство между кутикулой и внутренними структурами, а также вызывая постепенную деформацию брюшка (визуально оно округляется), что можно видеть невооружённым глазом. Кроме того, происходит выброс содержимого средней кишки в гемолимфу, ввиду чего она ощелачивается, что приводит к нарушениям в работе нервной системы, из-за чего личинки становятся вялыми и иногда даже парализованными. По мере скопления жидкости внутри тела разрушению подвергаются внутренние органы и в первую очередь органы дыхания – дорсальные трахейные стволы, просвет которых уменьшается, что в конечном итоге приводит к смерти (Рис. 30.3).

Принято считать, что за развитие инфекционного процесса у личинок отвечают не только Bt-токсины, но и фосфоинозитидспецифические фосфолипазы C (PLC), хитиназы и металлопротеазы, а также, в случае попадания бактерии в гемолимфу, токсины, чей синтез кодируется плазмидными генами vip и sip. PLC и хитиназы оказывают разрушающее действие на перитрофические структуры, защищающие эпителий средней кишки от механических повреждений, а металлопротеазы, помимо этого, ещё способствуют снижению клеточного и гуморального иммунитета личинки, регулируют активность кристаллических токсинов и способствуют формированию биоплёнки. Причём интересно, что сверхэкспрессия гена, гомологичного гену mogR у Listeria monocitogenes, зависящая от фазы роста бактерии и, вероятно, чувства кворума (у L. momocitogenes зависит от температуры), приводит к потере жгутикового аппарата бактерии, способствуя образованию биоплёнки.

Погибшая личинка создаёт благоприятную среду для вегетатив-

Рис. 30.3. Компьютерная томография (саггитальный срез) ► повреждений, возникающих у личинок жёлтолихорадочного комара (Aedes aegypti)

спустя полчаса (b), час (c) и 6 часов (d) после заражения B. thuringiensis subsp. israelensis в сравнении с контролем (а): Gc – желудочные слепые кишки, Vc – вакуоли, Fme – передний эпителий средней кишки, Fd – пища, Op – повреждения в эпителии средней кишки. Обратите внимание на образовавшиеся поперечные щели, указывающие на лизис клеток пищеварительного тракта, видимое округление брюшка и последующее разрешение внутренних органов

(по Alba-Tercedor J., 2023)

402

Раздел IV • 30. Экология B. thuringiensis

ного роста B. thuringiensis, однако это не позволяет ему выйти из конкурентной борьбы с другими микроорганизмами за питательные вещества. Поэтому некоторые штаммы синтезируют бактериоцины (т. е. проявляющие антимикробные свойства вещества) турицины. В частности, subsp. kurstaki производит Bn1, подавляющий рост почвенных грамотрицательных фитопатогенных бакте-

рий, таких как Paucimonas lemoignei, Pseudomonas syringae, Pseudomonas savastanoi, однако наибольшее влияние турицины всё же оказывают на грамположительные бактерии и собственно представителей B. cereus complex. Исследование< 1 > близлежащего пространства (филлосферы) стручкового перца (Capsicum annuum) до и после его обработки коммерческим препаратом, содержащим штамм subsp. kurstaki, показало существенное изменение видового состава почвенных бактерий. Если до обработки преобладали представители отдела Bacillota (ранее Firmicutes), то после обработки – отдела Gammaproteobacteria. В другом опыте< 2 > было показано, что

B. thuringiensis способен замещать Staphylococcus aureus в составе биоплёнки. Причём делает он это весьма красиво. В процессе движения по матриксу со скоростью до 16 мкм/с «трение» жгутиков приводит к образованию пор, которые за 2–5 секунд «затягиваются» (Рис. 30.4), но этого времени оказывается вполне достаточно, чтобы в матрикс попал синтезируемый бактерией лизостафин, подавляющий рост S. aureus. Тогда на освободившемся пространстве B. thuringiensis формирует собственную биоплёнку. С другой стороны, он может вступать и в симбиотические взаимоотношения. В частности, сообщается< 3 >, что сокультивирование с Rhizobium leguminosarum не только не приводит к подавлению роста последнего, но и стимулирует образование клубеньков гороха и чечевицы.

Вместе с тем B. thuringiensis не единственный, кто может синтезировать вещества, подавляющие рост конкурентов. Так, синтезируемые Pseudomonas fluorescens бактериоцины затрудняют размно-

1Zhang B., Bai Z., et al. Assessing the impact of the biological control agent Bacillus thuringiensis on the indigenous microbial community within the pepper plant phyllosphere. FEMS Microbiol Lett. 2008; 284(1):102–108; DOI: 10.1111/j.1574–6968.2008.01178.x.

2Houry A., Gohar M., et al. Bacterial swimmers that infiltrate and take over the biofilm matrix. PNAS. 2012; 109(32):13088–13093; DOI: 10.1073/pnas.1200791109.

3Mishra P. C., Mishra S., et al. Coinoculation of Bacillus thuringeinsis-KR1 with Rhizobium leguminosarum enhances plant growth and nodulation of pea (Pisum sativum L.) and lentil (Lens culinaris L.). World J Microbiol Biotechnol. 2009; 25:753–761; DOI: 10.1007/s11274–009–9963-z.

404

Мистерии сибирской язвы

Рис. 30.4. Временная пора в матриксе (слева) и траектория движения (справа)

B. thuringiensis по матриксу (по Houry A., 2012)

жение самого B. thuringiensis и способствуют его споруляции. В результате он сохраняется в виде споры и разносится различными животными (в отношении которых не проявляет активности), в частности, сельскохозяйственными животными, через их пищеварительный тракт, а также человеком через использование в сельском хозяйстве, занимая разнообразные ниши и в целом повторяя экологию B. cereus ss.

Март 1995 года<1>, Париж (Франция). В Военный учебный гос-

питаль Бежена (Hôpital d'instruction des armées Bégin) доставлен тяжело раненный взрывом наземной мины 28-летний солдат. Сразу после ранения, на поле боя, ему была проведена экстренная антибиотикотерапия (пенициллин G и метронидазол), после чего

1 Hernandez E., Ramisse F., et al. Bacillus thuringiensis subsp. konkukian (serotype H34) superinfection: Case report and experimental evidence of pathogenicity in immunosuppressed mice. J Clin Microbiol. 1998; 36(7):2138–2139; DOI: 10.1128/jcm.36.7.2138–2139.1998.

405

Раздел IV • 31. Скрытая угроза

его доставили в отделение неотложной помощи французского военного госпиталя в Сараево (Югославия, ныне – Босния и Герцеговина), где на фоне геморрагического шока, взрывной болезни лёгких, осколочных поражений левой ноги и множественных переломов левого колена ему была проведена операция. В течение 24 часов он был срочно доставлен в Париж.

На момент поступления обнаружено повышение температуры до 38,7 °С при нормальных значениях частоты сердечных сокращений, артериального давления и частоты дыхания. Анализ крови выявил лейкоцитоз (10,2 х 109/л при норме 4–9 х 109/л).

Микроскопическое исследование раневых тканей, полученных хирургическим путём (биопсии), выявило присутствие грамположительных палочек и спор, которые на кровяном агаре формировали белые крупные (5 мм) плоские колонии с шероховатыми краями и β-гемолизом. Биохимические тесты, проведённые с помощью анализаторов, дали противоречивый результат: B. cereus ss (API 50-CHB и 20-E) или B. thuringiensis (Vitek). С целью уточнения ви-

довой принадлежности изолят направили в Отделение энтомопатогенных бактерий Института Пастера (Unité des Bactéries Entomopathogènes, Institute Pasteur), где его идентифицировали как B. thuringiensis subsp. konkukian (серотип H34(1)).

Ввиду обнаружения устойчивости штамма к пенициллину и ампициллину антибиотикотерапия скорректирована на цифпрофлоксацин и гентамицин, вводимые в течение 10 дней. В дальнейшем проведено несколько хирургических операций, и на 15-й день пациент выздоровел.

Приведённый случай, по-видимому, является первым сообщением, в котором B. thuringiensis фигурирует в качестве возможного этиологического агента инфекции человека. Как и в случаях инфицирования B. cereus ss, описанных в Главе 27, он оказался единственной бактерией, обнаруженной «на месте преступления». Однако в отличие от B. cereus ss B. thuringiensis всегда считался (и счи-

1 Серотипирование по жгутиковым антигенам (Н-антигенам) проводят методом агглютинации со специфическими диагностическими сыворотками к 79 сероварам

B. thuringiensis (см. de Barjac H. Identification of H-serotypes of Bacillus thuringiensis, in Microbial control of pests and plant diseases. Ed.: H. D. Burges. London: The Academic Press Co., 1981, 949 p.).

406

Мистерии сибирской язвы

тается) исключительно энтомопатогеном, безопасным для человека (подкожное введение мышам не приводит к гибели). В данном случае также задались вопросом, не является ли находка просто контаминантом, поскольку, как мы помним, пациент подвергся экстренной антибиотикотерапии, поэтому есть вероятность, что реальный «преступник» уже понёс своё наказание.

Чтобы расставить все точки над i, в том же госпитале на мышиной модели изучили возможность штамма вызывать кожную инфекцию. Для этого 5-недельным самкам на депилированный участок кожи (2 см2) наносили бактериальную суспензию, причём одной группе мышей за 4 дня до эксперимента проводили иммуносупрессию путём внутривенной инъекции циклофосфамида (200 мг/кг массы тела). В результате кожное воспаление возникало при использовании концентрации не ниже 107/мышь, правда у иммунокомпетентных мышей инфекционный процесс саморазрешался к 48-му часу. Патологоанатомическое исследование показало присутствие B. thuringiensis на внутренней стороне кожи только у мышей, подвергшихся иммуносупрессии, поэтому вполне вероятно, что заражение пациента произошло исключительно на фоне сильного повреждения тканей.

Дальнейшее изучение штамма показало отсутствие на его хромосоме и единственной плазмиде рBT9727 известных генов, кодирующих синтез Bt-токсинов, что, однако, не отрицает возможности присутствия кодирующих их пока ещё неизвестных генов, поскольку наличие параспорального тела подтвердили визуально в Институте Пастера с помощью окраски фиксированного мазка кумасси синим. Однако сложность этой методики заключается в плохой аффинности (т. е. сродстве) красителя, поэтому целесообразнее для

визуализации параспоральных тел использовать<1> 0,1–1%-ный раствор кумасси бриллиантового синего G в 50%-ном растворе уксусной кислоты (как при окраске спор, см. Главу 21), который наносят на фиксированный мазок на полчаса, после чего промывают дистиллированной водой, высушивают и микроскопируют. В результате бактерии окрашиваются в светло-синий (голубой) цвет, а параспоральные тела – в тёмно-синий цвет (Рис. 31.1).

1 Хлопова К. В., Горшков-Кантакузен В. А., и др. К вопросу визуализации параспоральных тел и спор. Международный вестник ветеринарии. 2025. 3:84-89; DOI: 10.52419/issn2072-2419.2025.3.84.

407

патологоанатомическом исследовании обнаруживается отёк мышечной ткани, гиперемия сосудов со стороны инъекции и значительное количество экссудата, вытекающего в момент разреза кожи

(Рис. 31.2).

Интересно, что при культивировании споровой культуры в полужидком агаре (например, LB-агаре) обнаруживаются пузырьки газа (Рис. 31.3), в составе которого методом газовой хроматографии установлено присутствие СО2, что характерно для Clostridium perfringens, поскольку для представителей B. cereus complex характерно производство азота. И это вынуждает нас, во-первых, предполагать вклад газообразования в развитие отёков, о которых речь шла выше, поскольку у некоторых бактерий класса Clostridia встречается схожий механизм развития раневой инфекции, а, во-вторых, иными глазами взглянуть на сложности дифференцировки, о которых говорилось в Главах 16 и 27.

Конечно, кто-то может сказать, что опыты на мышах ещё не свидетельствуют о патогенности для человека. Однако уже сейчас имеются единичные сообщения о бактериемии, вызванной B. thu-

1 Хлопова К. В., Горшков-Кантакузен В. А., и др. B. thuringiensis как возможный этиологический агент раневой инфекции, в сб. XIII сборник научных работ «Важнейшие вопросы инфекционных и парази-

тарных болезней», Тюмень: ФБУН ТНИИКИП Роспотребнадзора. 2025.

408

Мистерии сибирской язвы

Рис. 31.2. Раневая инфекция у мыши, вызванная B. thuringiensis (эвтаназия на 2-е сутки; нижняя левая фотография прижизненная). Обратите внимание на воспаление в месте инъекции (чёрная стрелка), при вскрытии которого обнаруживаются гиперемия сосудов и отёк мышечной ткани, а также значительное количество экссудата, который вытекает в момент разреза кожи

ringiensis, у лиц, принимающих внутривенные наркотики< 1 >,( 2 ), а также о токсикоинфекции с рвотным и диарейным синдромом, вы-

1Kalinoski M. Bacillus thuringiensis bacteremia in an IV drug user. Am J Respir Crit Care Med. 2023; 207:A5336.

2Один случай наиболее показателен. В 2024 году 30-летний мужчина с анамнезом шизоаффективного расстройства, положительным результатом теста на антитела к гепатиту C, злоупотреблением комбинированными психоактивными веществами, внутривенным употреблением наркотиков и перенесённой спленэктомией (т. е. удаление селезёнки) обратился в отделение неотложной помощи Университетской больницы Статен-Айленда (Staten Island University Hospital), Нью-Йорк (США) с жалобами на лихорадку (38,3 ) и озноб. Других симптомов пациент не отмечал. Рентгенограмма грудной клетки не выявила отклонений. При осмотре выявлены двусторонние язвенные раны голеней от внутривенных инъекций в этих областях,

409