Мистерии сибирской язвы (учебник)

Раздел III • 29. Лабораторная диагностика B. cereus ss

Рис. 29.6. Положительный тест на фосфатазную (слева) и лецитиназную (справа) активности

реагента1 и 0,1 мл второго2. Далее осторожно встряхивают и оставляют на 10–15 минут. Появление розово-красного окрашивания свидетельствует о положительном результате, свойственном штаммам B. cereus ss в той или иной степени.

Кроме того, они проявляют гемолитическую (на 1-е сутки), протеолитическую, лецитиназную и фосфатазную активности 3 . Последние две особенно показательны, поскольку большая́ часть сибиреязвенных штаммов не способна разлагать фенолфталеинфосфат натрия и сворачивать желток (Рис. 29.6). Отличаются штаммы B. cereus ss также подвижностью (Рис. 21.8) и отсутствием капсулообразования, однако всё же встречаются как малоподвижные и неподвижные штаммы, так и способные к капсулообразованию. Догадались, какие? Конечно же, Bcbva и вызывающие сибиреязвенную пневмонию сварщиков (Рис. 29.7).

1Способ приготовления: в 100 мл этилового спирта растворить 5 г α-нафтола. Полученный раствор (почти бесцветный) допустимо хранить год при температуре

2–8 °С.

2Способ приготовления: к 40 г гидроксида калия на водяной бане добавляют 100 мл воды (избегать перегрева!). Полученный раствор допустимо хранить год в стеклянной таре, покрытой парафином или полиэтиленом.

3Методики приведены в Главе 21.

390

Мистерии сибирской язвы

Рис. 29.7. Продукция капсулы штаммами B. cereus ss G9241 (слева) и B. cereus ss Elc2 (справа); окраска тушью (слева по Hoffmaster A. R., 2004; Copyright (2004) National Academy of Science, USA, публикуется с разрешения правообладателя;

спрва по Wright A. M., 2011; © 2010 College of American Pathologists, публикуется с разрешения правообладателя). Оба штамма являются этиологическими агентами сибиреязвенной пневмонии сварщиков и привели к летальным исходам.

За синтез капсулы у первого штамма отвечает плазмида pBC210, тогда как генетические детерминанты, ответственные за капсулообразование, для второго не определены, однако примечательно, что генетически он близок штаммам

B. anthracis Ames Ancestor, B. cereus 03BB102 и B. thuringiensis Al Hakam

Для дифференцировки B. cereus ss от сапрофитных аэробов ис-

пользуют тест на способность к анаэробной ферментации глюкозы и маннита. Для этого исследуемую культуру уколом засевают в столбик питательной среды с глюкозой или маннитом, в которую дополнительно добавлен индикатор бромкрезоловый пурпурный. Спустя сутки инкубации при 37 °С при положительном результате среда окрашивается в жёлтый (жёлто-коричневый) цвет в случае глюкозы или не меняет цвет в случае маннита.

Помимо культуральных свойств штаммов исследуют их патогенность для лабораторных животных по методикам, представленным в Главе 22. Однако большинство штаммов B. cereus ss авирулентны для лабораторных животных (исключение составляют Bcbva и штаммы, вызывающие сибиреязвенную пневмонию сварщиков), а в случае «рвотных» и «диарейных» штаммов, чей патогенный потенциал связан в первую очередь с синтезом токсинов, необходимо исследовать токсичность, то есть заражать перорально, что

391

Раздел III • 29. Лабораторная диагностика B. cereus ss

тоже не показательно ввиду различий в строении желудочнокишечного тракта человека и используемых животных. Поэтому было предложено< 1 > вводить неочищенные центрифугированные супернатанты, причём внутрибрюшинно. Для этого споры возбудителя культивируют в богатой питательной среде, например, бульоне с сердечно-мозговым экстрактом (посевная доза 104/мл) при 37 °С и 160 об/мин в течение 18 часов. Далее центрифугируют 10 минут при 8000 об/мин для получения содержащих токсины супернатантов, которые можно хранить при минус 20 °С.

Заражение мышей проводят путём введения 500 мкл супернатанта внутрибрюшинно, наблюдение осуществляют в течение 7 дней. Обычно одним штаммом заражают несколько животных, и в этом случае падёж хотя бы одного животного свидетельствует о токсичности штамма, а гибель всех – о летальности. Как правило, штамм, синтезирующий хотя бы два токсина, является летальным.

Вместе с тем этот способ не позволяет определить, какой именно токсин синтезирует штамм. Ответить однозначно можно только с помощью высокоэффективной жидкостной хромато-масс-спектро-

метрии (ВЭЖХ-МС), с помощью которой можно разделить смесь на компоненты и определить масс-спектр каждого из них. Но этот способ трудоёмкий и дорогостоящий. Поэтому для обнаружения, например, цереулида предлагалось использовать тесты на кормление обезьян<2>, а также тесты, основанные на его способности вызывать вакуолизацию культур клеток линии HEp-2<3> и снижать подвижность свиных сперматозоидов из-за повреждающей митохондрии активности<4>. Но эти тесты, являющиеся косвенными, тоже не так просты в реализации. Наиболее простым и привычным видится обнаружение генов токсинов методом ПЦР5. Конечно, это ука-

1Хлопова К. В., Бахтеева И. В., и др. Способ определения острой токсичности супернатантов неантрацидных видов Bacillus cereus complex на мышиной модели, в сб. Материалы IX Национального конгресса бактериологов, Москва, 17–19 сентября 2024 года, М.: Издательство «Династия», 2024, 160 с.

2Melling J., Capel B. J., et al. Identification of a novel enterotoxigenic activity associated with Bacillus cereus. J Clin Pathol. 1976; 29(10):938–940; DOI: 10.1136/jcp.29.10.938.

3Finlay W. J., Logan N. A., et al. Semiautomated metabolic staining assay for Bacillus cereus emetic toxin. Appl Environ Microbiol. 1999; 65(4):1811–1812; DOI: 10.1128/AEM.65.4.1811–1812.1999.

4Hoornstra D., Andersson M. A., et al. A new method for in vitro detection of microbially produced mitochondrial toxins. Toxicol In Vitro. 2003; 17(5–6):745–751; DOI: 10.1016/s0887–2333(03)00097–3.

5RU 2837898 C1, 07.04.2025; RU 2839472 C1, 05.05.2025.

392

Мистерии сибирской язвы

жет только на присутствие генов, но не на их функциональность, однако в совокупности с определением токсичности на животных можно косвенно утверждать и о синтезе токсинов.

393

Раздел III • 29. Лабораторная диагностика B. cereus ss

394

Раздел IV

Bacillus thuringiensis

Раздел IV • 30. Экология B. thuringiensis

396

Мистерии сибирской язвы

1901 год. Инженер Исиватари́ Сигэтанэ́ 1 обнаруживает< 2 >, что причиной заболевания сотто (с яп. «обморок»), то есть обморока тутового шелкопряда (Bombyx mori), при котором личинка теряет аппетит, становится вялой и умирает, является бактерия, которой, по названию болезни, он даёт название Bacillus sotto. Однако поскольку его открытие не было опубликовано на одном из языков бактериологии того времени (немецком или французском), оно не было замечено за пределами Японии. Поэтому спустя 10 лет эту же бактерию как причину схожего по симптоматике заболевания flacherie (с нем. «вялый») у гусениц мельничной огнёвки (Ephestia kuehniella) переоткроет<3> Эрнст Берлинер́ 4. И поскольку дело происходит в Тюрингии (Германия), он даёт бактерии название Bacillus thuringiensis, под которым она и известна до сего дня. Что же касается названия B. sotto, то его в 1960 году присвоют одному из геноваров<5>, определённых в 1985 году как подтип<6>.

Эрнст Берлинер пишет: «Поражённые гусеницы внешне почти идентичны здоровым, за исключением того, что, подобно личинкам, готовящимся к окукливанию, они покидают место своего обитания. Однако им редко удаётся создать коконы. Болезнь стремительно прогрессирует, и вскоре обмякшие трупики висят на стенках или потолке своего контейнера. Тело тяжелобольной или погибшей гусеницы кажется мягким и дряблым, словно кожа обволакивает кашицу, а не упругие мас-

1, 1868–1941; японский инженер. Директор Киотосского института обучения шелководству (1908–1911).

2: ( ) ( ), ,

1901, 144, 1–5.

3Berliner E. Über die Schlaffsucht der Mehlmottenraupe (Ephestia kühniella Zell.) und ihren Erreger Bacillus thuringiensis n. sp. Zeitschrift für Angewandte Entomologie. 1915; 2(1):29–56; DOI: 10.1111/j.1439– 0418.1915.tb00334.x.

4Ernst Berliner, 1880–1957; германский биолог, бактериолог. В период нацизма подвергался расовым и политическим преследованиям, включая ограничения в работе и запрет на публикации.

5Heimpel A. M., Angus T. A. Bacterial insecticides. Bacteriol Rev. 1960; 24(3):266–288; DOI: 10.1128/br.24.3.266–288.1960.

6Shibano Y., Yamagata A., et al. Nucleotide sequence coding for the insecticidal fragment of the Bacillus thuringiensis crystal protein. Gene. 1985; 34(2–3):243–251; DOI: 10.1016/0378–1119(85)90133–7.

397

Мистерии сибирской язвы

вестно, что параспоральные тела B. thuringiensis содержат многокомпонентные кристаллические (Cry) и цитотоксические (Cyt) δ- эндотоксины, синтез которых кодируется плазмидными генами (поскольку генов много, условно их называют cry и cyt), поэтому отсутствие (потеря) плазмиды (плазмид), несущей эти гены, делает штамм авирулентным для личинок насекомых и, как уже говорилось ранее, генетически мало отличимым от B. cereus ss. Причём интересно, что обмен плазмидами возможен и осуществляется не только между штаммами

B. thuringiensis, но и B. cereus ss, B. mycoides и даже

B. anthracis! И тут сразу следует сказать, что внутри вида

B. thuringiensis традиционно выделяется большое количе-

ство подвидов1 (с одним из них, subsp. sotto, мы уже познакомились), многие из которых имеют собственные плазмиды и способны к токсинообразованию (причём каждый токсин активен в отношении личинок строго определённого круга насекомых), но только три из них наиболее часто применяются в сельском хозяйстве 2 :

1В настоящее время на основе геномных и фенотипических данных в этой классификации обнаруживается всё больше противоречий, однако она всё ещё «по привычке» используется специалистами. Иногда то, что принято считать фундаментом, так неповоротливо!

2Первый коммерческий препарат «Sporéine» стал выпускаться во Франции в 1938 году, а на сегодняшний день в сельском хозяйстве применяются препараты,

включающие подтипы kurstaki, israilensis, aizawai, san diego и tenebrionis.

399