Мистерии сибирской язвы (учебник)

Раздел II • 6. Ямальская вспышка

Рис. 6.2. Толщина активного (деятельного) слоя грунта (ALT) в зависимости от времени по данным мониторинга почв вечной мерзлоты (а) и среднегодовой температуры воздуха (b). Измерения с 2009 по 2010 год недостоверны и отмечены пунктиром. Относительное увеличение ALT составило 43 % в районах прерывистой мерзлоты (Надым) и 26 % в районах сплошной вечной мерзлоты (Васькины дачи). Обратите внимание, что динамика изменения ALT в районах вечной мерзлоты соответствует динамике изменений среднегодовой температуры воздуха (по Ezhova E., 2021)

того слоя, который подвергается ежегодному оттаиванию на территориях вечной мерзлоты, увеличилась в районах прерывистой и сплошной областей вечной мерзлоты на 43 и 26 % соответственно. Таким образом, имело место постепенное оттаивание вечной мерзлоты как минимум с 2014 года (если не с 2011 года, как можно видеть из графика).

С другой стороны, как и отмечалось выше, в районе Нового Порта (Рис. 6.1-а) имеется тенденция к уменьшению количества летних осадков, тогда как в Ныде, расположенной на другом берегу Обской губы, наоборот, количество осадков ежегодно увеличивается, что, вероятно, связано с потеплением и усилением озеленения. Так, в июле 2016 года в Новом Порту действительно выпало лишь 5 % от климатической нормы. Дело в том, что постепенное отступление морского льда на фоне глобального потепления неизбежно приводит к плавному увеличению осадков и, как следствие, увеличению снежных покровов в зимний период (меньшему промерзанию почвы) и озеленению в летний. И поскольку Новый Порт располагается севернее, эти процессы там не так активны, как в Ныде,

100

Мистерии сибирской язвы

куда летом и уходит циклон. В этой ситуации растения, которым не хватает влаги летом, вытягивают воду корнями из более глубоких слоёв почвы, что способствует выносу спор сибирской язвы, которые, вероятнее всего, сокрыты в глубинах вечной мерзлоты1, на поверхность, где их с сухой травой потребляют олени. Далее при низкой дозе споры спокойно проходят через желудочно-кишечный тракт животного (либо инфекция протекает в латентной форме) и с калом снова оказываются в почве(2). При этом если олени в поисках пищи перемещаются южнее, то споры могут попасть в почвы, подходящие для выживания, поскольку усиление озеленения способствует их обогащению гумусом и, как следствие, изменению рН на более благоприятный для возбудителя, из-за чего возможно не только его сохранение, но и накапливание. Таким образом, следует заключить, что реальная экология B. anthracis значительно сложнее того, что было описано в предыдущей главе(3), а глобальное изменение климата также является важным фактором, вносящим свой вклад в сохранение и распространение возбудителя. Поэтому наиболее надёжным способом предотвращения эпизоотий на сегодняшний день является вакцинопрофилактика восприимчивых контингентов4, поскольку даже многолетнее отсутствие эпизоотии и кажущиеся неподходящими для выживания возбудителя условия, как показали события 2016 года, не являются гарантией защиты от вспышек сибирской язвы.

1К настоящему времени всё ещё неизвестно, в каком виде существует возбудитель, однако предполагается, что он может сохраняться не только в виде спор в почве, но и в виде вегетативных клеток в трупах замороженных животных.

2Незначительное количество спор обычно транзитно проходит через желудоч- но-кишечный тракт животного, не вызывая инфекцию, однако в случае наличия повреждений слизистой оболочки (язвы и т. п.) споры способны «закрепиться» и размножиться до количества, необходимого для развития инфекции (т. е. минимальной инфицирующей дозы), что было показано в опыте по заражению свиней после кормления битым стеклом (неопубликованные данные).

3Обратите внимание, что, несмотря на существующую устойчивость молодняка оленей к возбудителю, во время этой вспышки именно они составили бо́льшую часть павших животных.

4Временной разброс между вспышкой заболевания и датой прекращения вакцинации может объясняться как снижением популяционного иммунитета, так и накоплением возбудителя до минимальной инфицирующей дозы.

101

Раздел II • 7. Патогенез

Из предыдущих глав мы знаем, что сибиреязвенный микроб попадает в восприимчивый организм через потребление с пищей (алиментарный путь), контакт с инфицированным животным (кон-

тактный механизм), вдыхание (аэрогенный механизм) и реже через укусы кровососущих двукрылых (трансмиссивный механизм) и повреждённые кожные покровы, в основном при загрязнении их контаминированной землёй (контактный механизм). Если говорить о человеке, то заражение также возможно при работе с инфицированными шкурами (воздушно-пылевой путь). Таким образом, входными воротами инфекции могут быть ротовая полость, желудочнокишечный тракт, лёгкие и кожа, но где бы ни оказался сибиреязвенный микроб, он столкнётся с важной составляющей врождённого гуморального иммунного ответа, именуемой система комплемента, активации которой по альтернативному пути будет противостоять поверхностный белок BclA – та самая «ворсинка» на поверхности споры. Во-первых, BclA связывается с фактором комплемента Н, препятствуя тем самым связыванию фрагмента С3b с поверхностью споры и, как следствие, ингибируя нисходящую активацию системы комплемента.

Напомним, что альтернативный путь активации системы комплемента реализуется в результате спонтанного гидролиза белка С3 в плазме крови на фрагменты С3b и С3а, и последующего связывания С3b с поверхностью бактериальной клетки (споры). Далее С3b связывается с С3-конвертазой, в результате чего образуется С5конвертаза, которая разрезает белок С5, чьи фрагменты привлекают фагоциты в очаг инфекции, а также запускает формирование мембраноатакующего комплекса, формирующего поры в мембране бактериальной клетки. При этом, чтобы исключить активацию комплемента на собственные клетки организма, в системе присутствуют регуляторы, в числе которых уже упомянутый фактор комплемента Н, связывающий С3b и, соответственно, не дающий ему связаться с С3-конвертазой, что и останавливает нисходящую активацию. Именно эту стратегию и избрал сибиреязвенный микроб. Кроме того, BclA связывается с сывороточным плазмино-

102

Мистерии сибирской язвы

геном, что придаёт споре способность расщеплять всё тот же фрагмент С3b, если он смог-таки достичь её поверхности, и таким образом останавливать нисходящую активацию. Далее спора, в ответ на снижение кислорода и наличие питательных веществ, прорастает в вегетативную клетку1 (только в случае лёгких этот процесс протекает медленнее), и тогда уже синтезированная капсула будет обеспечивать уклонение от системы комплемента.

На первой стадии инфекционного процесса, именуемой продромальной, вегетативная клетка сталкивается с первой линией защиты организма, в качестве которой выступают катионные антимикробные пептиды, секретируемые эпителиальными клетками кожи, дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта, а также нейтрофилами и NK-клетками. Целью пептидов является клеточная стенка, взаимодействие с которой приводит к гибели бактерии, поэтому последние эволюционно выработали множество стратегий сопротивления, среди которых электростатическое отталкивание пептидов, эффлюксные насосы, а также синтез белков, разрушающих или экранирующих пептиды. Сибиреязвенный микроб использует только две стратегии. Во-первых, он повышает положительный заряд клеточной стенки за счёт синтеза лизилфосфатидилглицеринов и аланилирования техоевых кислот (последнее обеспечивается системой этерификации D-аланина, кодируемой опероном dltABCD), ввиду чего положительно заряженные пептиды отталкиваются от одноимённо заряженной клеточной поверхности. Во-вторых, он синтезирует протеазы, например, протеазу против человеческого катионного антимикробного пептида LL-37, широко секретируемого организмом, особенно в ранах, на поверхности дыхательных путей и слизистых оболочек. Экспериментально было показано<2>, что сибиреязвенный микроб обладает самым высоким уровнем устойчивости к этому пептиду среди своих ближайших родственников. Так, 50%-ная ингибирующая рост концентрация LL-37 для B. anthracis составляет 40–60 мкг/мл, тогда как для

1Ранее считалось, что споры уносятся фагоцитами в дренирующие лимфатические узлы и прорастают уже в них, поэтому эти сведения всё ещё можно встретить в научной литературе.

2Thwaite J. E., Hibbs S., et al. Proteolytic degradation of human antimicrobial peptide LL-37 by Bacillus anthracis may contribute to virulence. Antimicrob Agents Chemother. 2006; 50(7):2316–2322; DOI: 10.1128/AAC.01488–05.

103

Раздел II • 7. Патогенез

B. thuringiensis – 37

мкг/мл, для B. cereus – 33 мкг/мл.

Кроме того, в ответ на факторы окружающей среды (температуру млекопитающего, повышение концентрации углекислого газа и бикарбоната) активируется ген atxA, опосредованно запускающий синтез отрицательно заряженной капсулы, которая связывает пептиды за счёт разноимённости зарядов. Особенно эффективно связывание в отношении челове-

ческих дефензинов, за исключением β-дефензина 3 (НBD-3), который хотя и задерживается капсулой, всё же способен «добраться» до клеточной стенки и вызвать гибель бактерии (Рис. 7.1).

Помимо капсулообразования, как мы помним из Главы 3 (если нет, то перечитайте её), atxA запускает синтез протективного антигена (РА), а также летального фактора (LF) и отёчного фактора (EF). Первый связывается со специфическими рецепторами клеток (ANTXR и другими) и расщепляется на фрагменты РА20 и РА63, после чего фрагмент РА63 образует комплексы с летальным и отёчным факторами, образуя, соответственно, летальный токсин (LF + PA) и отёчный токсин (EF + PA). Затем токсины диффундируют в кровь и быстро разносятся по организму, попадая в межклеточное пространство, где нарушают сигнальные взаимодействия между клетками, а также проникают в клетки. При этом важно понимать, что специфические рецепторы имеются почти на всех

104

Мистерии сибирской язвы

клетках восприимчивых организмов, поэтому токсины проникают во многие клетки, включая иммунные. Внутри клетки комплекс токсина (LF + PA и EF + PA) распадается, высвобождая летальный и отёчный факторы, которые оказывают на них следующие воздействия: летальный фактор расщепляет митоген-активируемые киназы клетки, что нарушает сигнальные пути, а отёчный фактор увеличивает синтез циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), что в случае иммунных клеток приводит к синтезу IL-6 и ингибированию TNF-α, а также к ингибированию окислительного взрыва, то есть этапа фагоцитоза, при котором возбудитель подвергается воздействию активных форм кислорода.

Среди всех иммунных клеток первыми к месту инфекции обычно прибывают нейтрофилы, но чаще всего они связаны только с кожной инвазией и редко привлекаются в случае лёгочного заражения (исключение тут составляют только собаки и свиньи). Нейтрофилы активно захватывают споры и вегетативные клетки, несмотря на их размер (Рис. 7.2). Захваченные споры, как правило, спокойно прорастают внутри нейтрофила, после чего уже вегетативные клетки подвергаются действию α-дефензинов, поскольку активным формам кислорода успешно противостоит отёчный фактор. В результате уже через 3 часа погибает до 30 % захваченных бактерий, а через 4 часа – 70 %. При этом в случае штаммов, содержащих только одну плазмиду, к четвёртому часу уничтожается более 90 % бактерий, продуцирующих только токсин (рХО1+рХО2–), и 80 % бактерий, продуцирующих только капсулу (рХО1–рХО2+). Что это означает? Инфекция оказывается локализованной в месте очага, поэтому кожные инвазии у человека чаще всего протекают без системного распространения, а собаки и свиньи оказываются мало восприимчивыми к лёгочным инфекциям и выживают даже при ингалировании высоких доз возбудителя, поскольку в их лёгкие прибывает достаточное количество нейтрофилов.

С макрофагами всё несколько сложнее. Дело в том, что BclA, защищающий споры от активации системы комплемента по альтернативному пути, способен связываться с субъединицей С1q белка С1, активируя классический путь системы без участия антител (напомним, что в норме активация происходит при взаимодействии C1q с антителом), что приводит к поглощению спор макро-

105

Раздел II • 7. Патогенез

Рис. 7.2. Споры (наконечник стрелки) и вегетативные клетки (стрелка) B. anthracis, захваченные человеческими нейтрофилами через 90 мин (А) и 180

мин (В), а также в момент поглощения (С). Увеличенные вставки на А и В приведены для наглядности; просвечивающая (А, В) и сканирующая (С) электронная микроскопия (по Mayer-Scholl A., 2005). Обратите внимание, что нейтрофилы позволяют спорам прорасти, ввиду чего на В их почти нет, а также, что они способны поглотить вегетативные клетки, несмотря на их размер!

фагами. Дальнейшее пребывание бактерии в макрофаге (даже в случае поглощения вегетативной клетки) приводит к активации инфламмасомы1 NLRP1, что запускает внутри макрофага воспалительный сигнальный каскад, приводящий к программируемой клеточной гибели, именуемой пироптозом, при которой внутри макрофага синтезируются IL-1β и IL-18, а каспаза-1 нарушает целостность плазматической мембраны, в результате чего в клетку устремляются ионы и вода, что приводит к её набуханию, лизису и, соответственно, высвобождению значительного количества синтезированных IL-1β и IL-18. Этот защитный механизм врождённого

1 Мультибелковый олигомерный комплекс, отвечающий за секрецию IL-1β и

IL-18; от англ. inflammation – «воспаление».

106

Мистерии сибирской язвы

иммунитета организма необходим для ограничения внутриклеточного размножения патогена. И действительно, летальный фактор сибиреязвенного микроба, расщепляя N-конец белков инфламмасомы NLRP1, тем самым активирует её, однако в случае человека этого не происходит, поскольку те белки, на которые нацелен летальный фактор, у человеческой инфламмасомы NLRP1 отсутствуют. И это играет злую шутку, поскольку если у животных пироптоз макрофагов позволяет привлечь дополнительные нейтрофилы и «сконцентрировать» инфекцию(1), то в случае человека сибиреязвенный микроб захватывается макрофагами2 и, как в такси, уносится ими к последнему барьеру на пути системного распространения

– дренирующим место инвазии лимфатическим узлам. В фаголизосоме макрофага, как ранее считалось, он, окружённый капсулой, противостоит негативному воздействию среды и благодаря действию отёчного фактора и антролизина О(3) подавляет фагоцитоз. Особенно хорошо это работает в случае спор, захваченных в лёгких альвеолярными макрофагами, ведь, как уже говорилось в Главе 2, экзоспорий содержит аргиназу, снижающую концентрацию оксида азота в макрофагах (напомним: из-за конкуренции с синтазой оксида азота за L-аргинин), а при прорастании синтезируется белок CotR, структурно похожий на фосфолипазы, также препятствующие фагоцитозу. Однако реальность, как выясняется< 4 >, обстоит иначе: только 20 % спор и вегетативных клеток смогут пере-

1Следует оговориться, что этот механизм хорошо работает только в случае штаммов, на поверхности спор которых синтезирована антроза. В случае же антро- за-отрицательных штаммов (ant–) имеет место задержка в споропрорастании, поэтому макрофаг захватывает и уносит в лимфатический узел спору, которая легко переживает фагоцитоз, прорастая уже вне макрофага. И даже в том случае, если спора прорастёт внутри макрофага, антроза-отрицательные штаммы синтезируют меньше летального и отёчного фактора (по сравнению с ant+), которых оказывается недостаточно для активации инфламмасомы NLRP1 и, следовательно, запуска пироптоза.

2Как правило, путём активации TLR2 и MyD88.

3Токсин из семейства холестерин-зависимых цитолизинов, который способен сформировать пору в мембране, взаимодействуя с содержащимся в ней холестерином. Механизм его действия до конца не ясен, однако установлено, что он обладает

литической активностью против фагоцитов (см. Mosser E. M., Rest R. F. The Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin, Anthrolysin O, kills human neutrophils, monocytes and macrophages. BMC Microbiol.

2006; 6:56; DOI: 10.1186/1471–2180–6–56).

4 Hu H., Sa Q., et al. Inactivation of Bacillus anthracis spores in murine primary macrophages. Cell Microbiol. 2006; 8(10):1634–1642; DOI: 10.1111/j.1462–5822.2006.00738.x.

107

Мистерии сибирской язвы

вызвать воспалительную реакцию в лимфатическом узле (лимфаденит), прорвать этот барьер(1) (Рис. 7.4) и проникнуть в лимфатическую систему (геморрагический лимфаденит), а оттуда – уже в системный кровоток (бактериемия). Конечно, какая-то часть бактериальных клеток переживает фагоцитоз, но её явно будет недостаточно для «прорыва» лимфатического узла и уж тем более системного распространения. И вот тут начинается самое интересное. Дело в том, что дендритные клетки мало устойчивы к действию B. anthracis, но способны достаточно быстро добраться до лимфатического узла, а в случае лёгочной инвазии ещё и легко пересекают тонкий слой эндотелиальных клеток, доставляя бактерии напрямую в кровеносную систему. Именно поэтому они являются тем «троянским конём», который открывает бактерии путь к системному распространению2. Кроме того, споры из лёгких по лимфатическим сосудам мигрируют в лимфатические узлы средостения, которые расположены в центральной части грудной клетки между лёгкими и в чьи функции входит обеспечение отвода лимфы из лёгких (Рис. 7.5). Также, вероятно, бактерии в лимфатические узлы средостения могут попадать из селезёночного резервуара.

С этого момента наступает системный этап инфекционного процесса, при котором бактерии стремительно размножаются в крови, достигая концентрации 109 бактерий/мл, разносясь по целевым тканям и органам, которые, как правило, сильно васкуляризованы: сердце, лёгкие, лёгочная паренхима, головной мозг, селезёнка, печень, почки и кишечник. Интересно, что в лёгких под действием кислорода бактерии формируют споры, которые прилипают к альвеолярному эпителию (поэтому они не выделяются с дыханием во внешнюю среду), а некоторые даже обнаруживаются внутри эпителиальных клеток(3). Сохранение в лёгких настолько эф-

1 Интересно, что наибольшее повреждение наносят не бактериальные клетки, а вызванная в ответ на них острая воспалительная реакция, приводящая к появлению

297 уникальных белков, из которых только 83 являются общими с лимфой (см.

Popova T. G., Espina V., et al. Whole proteome analysis of mouse lymph nodes in cutaneous anthrax. PLoS One. 2014; 9(10):e110873; DOI: 10.1371/journal.pone.0110873)

2Сравните эту стратегию с той, которую использует чумной микроб (Глава 13 Оперы о чуме).

3Проникновение осуществляется за счёт связывания BclA с интегрином α2β1 поверхности эпителиальной клетки через лиганд, в качестве которого выступает фак-

109