Belan_Allergen_specificheskaya_2019

та связывания на аллергене, что предотвращает вызванную аллергеном активацию базофилов и соответственно высвобождение медиаторов. Протективная функция блокирующих антител может наблюдаться в ранней и поздней фазах аллергического ответа. В связи с этим ставился вопрос о возможности пассивного введения блокирующих антител при лечении аллергических заболеваний. Однако против модели блокируюших антител выдвигаются возражения. Одно из них основывается на слабой корреляции между концентрацией IgG и клиническим эффектом. Особенно это показательно в некоторых исследованиях в случае применения при АСИТ сверхударных доз: по-

зитивный результат наблюдается задолго до обнаружения продук-

ции IgG антител. Данный факт свидетельствует о множественности механизмов, позволяющих формировать иммунологическую толерантность в процессе АСИТ.

Проблема гистогематических барьеров при АСИТ

Еще в 1970-е годы было высказано предположение о том, что нарушение проницаемости барьерных тканей для аллергенов является решающей формой предрасположенности к аллергии. Именно в барьерных тканях активируются местные дендритные клетки, регулируется стимулируемый цитокинами аллерген-специфический Th2-ответ и формируются механизмы периферической толерантности.

Особенно существенный прогресс достигнут в изучении роли межэпителиальных контактов: плотных контактов; десмосом; зон слипания, или промежуточных контактов. Плотные контакты охватывают по периметру каждую эпителиальную клетку, запирая межклеточные пространства в поверхностной части на границе с внешней средой или просветом дыхательного или пищеварительного тракта. Их дефект открывает входные ворота для экзогенных веществ, включая аллергены. Десмосомы – это контакты, выполняющие функцию механической связи между клетками. Зоны слипания представляют собой особый тип межклеточного соединения: они располагаются в базальной части эпителиальных клеток и опоясывают их лентами или

40

образуют пункты прикрепления к внеклеточному матриксу. Выявлены специфические белки этих контактных зон: кадгерины, десмоглеины, десмоколлины, винкулин, плакоглобин, филагрин и др. Продемонстрировано для респираторного эпителия, что ряд аллергенов (например, клещ домашней пыли) обладает протеазами и нарушает его барьерную функцию. Есть факторы, провоцирующие повреждение барьера дыхательных путей: вирусы, табачный дым и др. Нарушение эпидермального барьера найдено при мутации гена филагрина (один из ключевых белков, присутствующий в эпидермисе кожи уже на третьем месяце жизни ребенка и препятствующий потере воды через роговой слой), что способствует развитию атопического дерматита (табл. 7).

Таблица 7

Сходство и различия механизмов подкожной и сублингвальной АСИТ (AkdisC.A., AkdisM., 2014, с изменениями16)

16Akdis M., and Akdis C.A. Mechanisms of allergen-specific immunotherapy: multiple suppressor factors at work in immune tolerance to allergens // J Allergy Clin Immunol. 2014. Vol. 133 (3). Р. 621–31.

41

4.1. Гипоаллергенные молекулы, пептиды, адъюванты с иммуномодулирующими свойствами

Другим важным направлением перспективных исследований является разработка синтетических пептидов, представляющих T- клеточные эпитопы аллергенов и аутоантигены. Также разрабатываются и пептиды, содержащие B-клеточный эпитоп. По-прежнему будет уделяться внимание очистке рекомбинантных аллергенов, приготовлению гипоаллергенных изоформ.

Приоритетная роль отводится и новым формам адъювантов, призванных снижать дозу вводимого аллергена без уменьшения клинического эффекта. Здесь предлагают использовать адъюванты, приготовленные из бактериальных оболочек, и ДНК-адъюванты. Хорошо зарекомендовал себя выделенный из бактерий монофосфорил-липид A (MPLA), являющийся нетоксичным, хорошо переносимым и способным вызывать выраженный Th1 ответ у человека. Среди потенциальных адъювантов выделяют ДНК прокариот, которая распознается Toll-подобным рецептором 9: уже получен ДНК-конъюгированный аллерген Amb a1 (амброзия полыннолистная), находящийся в фазе II клинических испытаний.

Пути получения препаратов на основе аллергенов:

-полимеризация «диких» аллергенов (аллергенность триммера Bet v1 (пыльца березы) по некоторым данным, в 100 раз ниже, чем у «дикого» аллергена));

-использование site-направленного мутагенеза с целью снижения аллергенности препарата при максимальной сохранности структуры. Гипоаллергенные препараты пыльцы деревьев и клеща домашней пыли получены путем значимых изменений в ДНК, направленных на сохранение Т-клеточных эпитопов при снижении аллергенности вещества;

-слияние мажорных аллергенов (например, аллергенов пчелы Api m1 и Api m2 с целью удаления B-клеточных эпитопов при сохранении Т-клеточных). Эффективность АСИТ с использованием рекомбинант-

43

ного аллергена пыльцы березы Bet v1 ассоциируется с достижением достоверно более высокого уровня IgG и более эффективного подавления кожных проб по сравнению со водно-солевым экстрактом;

-использование в процессе АСИТ агонистов toll-like рецепторов (в частности, TLR4 и TLR9) может способствовать дополнительной индукции Th1-фенотипа иммунного ответа. В литературе имеются данные об успешном применении низкомолекулярного экстракта пыльцы растений (Pollinex Quattro, USA), сорбированного на L- тирозине глютаральдегид-модифицированного монофосфорилированного липида А, являющегося агонистом TLR4. На различной стадии изучения находятся несколько препаратов, представляющих собой сорбированные на аллергене CpG (цитозин-фосфат-гуанин динуклеотид) иммуностимуляторные последовательности;

-создание пептидов, содержащих эпитопы аллергена (IgE не распознает фрагментированные аллергены, а также перекрестно не сшиваются им, что предотвращает дегрануляцию тучных клеток. Пептиды не связывются с Т-лимфоцитами без антигенпрезентирующих клеток, что предотвращает развитие поздней фазы аллергической реакции). В настоящее время известны препараты аллергена кошки Fel d1, содержащего 27 аминокислотных остатков и аллергена пчелы Api m1;

-АСИТ в сочетании с омализумабом (моноклональные анти- IgE-антитела) ассоциируется с большей эффективность лечения при большей безопасности у больных с БА при сенсибилизации к пыльце амброзии;

-химическая модификация аллергенов;

-использования комплекса аллергенов. Большинство исследований, приводимых в литературе, касаются лечения одним этиологически значимым аллергеном. Результаты, касающиеся одновременного введения больным комплекса аллергенов, разрозненны и конфликтны. Тем не менее полученные нами данные свидетельствуют о том, что классическая АСИТ у детей, страдающих аллергическим ринитом с поливалентной сенсибилизацией, не только является эффек-

44

тивным методом лечения, но и приводит к снижению заболеваемости бронхиальной астмой.

4.2. Химическая модификация аллергенов

Денатурация

Простейшим методом удаления конформационных эпитопов из аллергенов является тепловая денатурация. Хорошо известно, что приготовленные продукты обычно лучше переносятся аллергиками, вероятно, из-за неспособности IgE связывать денатурированный и агрегированный антиген.

Химическая сшивка молекул

Обработка альдегидами, такими как формальдегид или глутаральдегид, приводит к образованию химических связей в белках. Это ведет к появлению олигомеров с высокой молекулярной массой, которые скрывают нативные эпитопы. Антиген, обработанный глутаральдегидом (рис. 12), значительно уменьшает связывание с IgE, что снижает аллергенность, сохраняя при этом иммуногенные свойства нативного антигена. ПКИТ проведенная несколькими различными экстрактами, подвергшимися обработке альдегидом, хорошо переносится у пациентов с аллергией и успешно индуцирует толерантность. Также эта методика индуцирует благоприятное соотношение IgG4/IgE по сравнению с плацебо.

Карбамилирование

Изоциановая кислота вступает в реакцию со свободными аминогруппами (лизин и аргинин) на белках, ингибируя образование химических связей и изменяя конформацию эпитопов. Такие антигены представлены уже мономерами с низкой молекулярной массой, что позволяет облегчить прохождение барьеров слизистой оболочки по сравнению с антигенами, модифицированными альдегидом. Как и

45

при альдегидной сшивке, нарушение конформационных эпитопов в мономерных аллергенах делает их менее доступными для связывания с IgE, но сохраняет иммуногенность, включая индукцию антигенспецифических IgG-антител.

Рис.12. Схема получения полимеризованных аллергенов

(аллергоиды) (Pattersonetal. J Allergy Clin Immunol, 197717)

Синтетические пептиды

Основными преимуществами пептида, а не цельного белка или белкового экстракта, является использование хорошо охарактеризованного антигена (антигенного эпитопа) и, что более важно, снижение способности связывать IgE и индуцировать нежелательные явления, поскольку специфичность IgE обычно развивается против конформационных эпитопов третичной или четвертичной структуры белков, которых нет у коротких пептидных фрагментов. Однако пептиды способны распознаваться T-клеточным рецептором (TCR), поэтому сохраняют иммуногенность при минимальной своей аллерген-

17Patterson R., Suszko I.M., Pruzansky J.J., Zeiss C.R., Metzger W.J., Roberts M. Polymerization of grass allergens // J Allergy Clin Immunol. 1977. Vol. 59. Р. 314.

46

ности. Минус пептидной иммунотерапии в том, что только один из подтипов эпитопов Т-клеток может быть покрыт одним пептидом, а аллерген, как известно, может содержать несколько антигенных эпитопов, тем более несколько аллергенов от одного источника. Поэтому для стандартизованного АСИТ требуется микс из пептидов, охватывающих несколько эпитопов. Клиническое исследование АСИТ со смесью семью пептидов, полученных из аллергена кошки Feld1, продемонстрировало снижение аллергенности (побочных эффектов), но аналогичную иммуногенность по сравнению с целым Feld1.

Рекомбинантные аллергены и ДНК-вакцины

В 1988–1989 гг. были клонированы кДНК аллергенов (главный аллерген яда пятнистой осы, главный аллерген клеща домашней пыли Der p1, главный аллерген березовой пыльцы Bet v1). В начале 1990-х годов рекомбинантные аллергены стали применять для диагностики in vitro. Позже предложили использовать рекомбинантные гипоаллергены у пациентов при осуществлении провокационного теста. В начале 2000-х годов были проведены первые контролируемые исследования АСИТ с помощью рекомбинантных аллергенов: сначала на гипоаллергенах, а затем на аллергенах дикого типа. Принципиальным фактом представляется четкое обнаружение индукции аллергенспецифических IgG антител, тормозящих немедленное и хроническое аллергическое воспаление. В 2006–2010 гг. были осуществлены исследования влияния СЛИТ с использованием рекомбинантных аллергенов, однако требуются дальнейшие широкомасштабные исследования эффективности и безопасности. Начиная с 2008 г. рекомбинантные аллергены служат как референс-материалы для аллергенных продуктов (особенно это касается главных аллергенов).

Такая новая технология облегчит стандартизацию аллергенных препаратов, позволив количественно определять главные аллергены в производственных сериях лекарственных форм. Одним из таких подходов было создание рекомбинантного слитого белка двух основных аллергенов пчелиного яда Apim1 и Apim2. Было обнаружено, что эта бел-

47

ковая химера имеет уменьшенное связывание с IgE и IgG антителами от больных с аллергией на пчел и проявляет снижение аллергенности, а следовательно, и побочных реакций. Другая группа исследователей создала модифицированные формы основных аллергенов арахиса Arah1, 2 и 3 с точечными мутациями аминокислот в критических сайтах связывания IgE. Эти мутантные белки продемонстрировали пониженную аллергенность, определяемую IgE-связыванием, но сохраняли способность стимулировать Т-клеточные реакции.

На рис. 13 представлена схема, иллюстрирующая получение рекомбинантных продуктов на основе структуры генов естественных аллергенов (пыльца, пища, перхоть животных, яд перепончатокрылых, клещ домашней пыли, плесень).

Рис. 13. Типы препаратов для АСИТ (Linhart B., 200518)

18Linhart B., Valenta R. Molecular design of allergy vaccines // Current Opinion in Immunology. 2005. Vol. 17.

48

Адъюванты

Адъюванты представляют собой вещества, которые при совместном введении с антигеном усиливают иммунный ответ в желаемом направлении. Однако адъюванты не только активируют эффекторный иммунный ответ, но также могут способствовать толерогенным ответам. Совместное введение антигена с соответствующим адъювантом может приводить к ответам Th1, чтобы конкурировать с Th2опосредованной гиперчувствительностью, а также ответами Treg для активного подавления воспаления.

Квасцы (соединения алюминия)

Адсорбция антигена на соли алюминия является одним из старейших и наиболее распространенных способов повышения иммуногенности при вакцинации. Однако инъекция квасцов приводит к быстрому притоку эозинофилов, нейтрофилов, моноцитов, дендритных клеток, NK- и NKT-клеток. Эти клетки, а также резидентные клетки, такие как макрофаги и тучные клетки, продуцируют различные провоспалительные цитокины и хемокины, включая IL-1b, IL-4, IL-5, IL- 6 и гистамин. Эта воспалительная среда, вероятно, ответственна за сильное смещение Th2 иммунных ответов при индукции квасцов, что наблюдается у мышей. Несмотря на предрасположенность к Th2иммунным ответам в экспериментах на мышах, квасцы были широко используемым адъювантом для ПКИТ в Европе, где клинические испытания с использованием алюмоаммуната оказались успешными при лечении аллергии. Однако в дополнение к вышеупомянутой предрасположенности к Тh2-ответам, подкожные инъекции квасцов связаны с образованием гранулем.

Агонисты TLR

Toll-подобные рецепторы (TLR) являются молекулами, которые распознают патоген-ассоциированные молекулярные структуры и вызывают устойчивые иммунные ответы. Адъюванты, нацеленные на TLR с последующей индукцией Th1, могут применяться для АСИТ.

49