Laboratornye_metody_ocenki_gumoralnogo_zvena_immuniteta_ Belan_E_B2021
.pdf(классический или альтернативный путь активации комплемента, соответственно). Растворение ЦИК под действием комплемента является очень важным процессом удаления их из организма. Однако определяющим фактором при измерении КСА является размер ЦИК, мелкие ЦИК не растворяются под действием комплемента даже при значительном его избытке в растворе.
2.Определение ЦИК с использованием антииммуноглобулиновых антител, в частности ревматоидного фактора (РФ), позволяет выявить IgG-содержащие ЦИК в довольно широком диапазоне молекулярной массы комплексов. Основным их недостатком является получение ложноположительных результатов при наличии в исследуемом образце агрегированного IgG или собственного РФ.
3.Определение ЦИК при взаимодействии с рецепторами различных клеток. Наиболее известен метод с использованием клеток лимфобластной линии (клеток Raji), который позволяет определить небольшие ЦИК, несущие СЗb и отличается высокой чувствительностью и специфичностью, однако, трудоемкость и сложность технологии культивирования клеток ограничивают использование данной группы методов.
Методы, основанные на физико-химических свойствах ЦИК
Наибольшее число методов определения ЦИК разработано на основе использования линейного незаряженного полимера полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 6000, которые позволяют определять различные по молекулярной массе и размерам комплексы (прямо пропорцио-
–60 –
нально концентрации ПЭГ), как комплементфиксирующие, так и не связывающие комплемент. Показано, что увеличение содержания ЦИК в ПЭГ-преципитате коррелирует с некоторыми клиническими состояниями.
Клиническое значение определения ЦИК
Заболевания, при которых повышена концентрация ЦИК:
1.Аутоиммунные заболевания. Классическим примером генерализованной реакции иммунных комплексов является системная красная волчанка. При ревматоидном артрите главную роль играют внутрисуставные и периартикулярные механизмы; в некоторых случаях наблюдают генерализацию процесса, которая ведет к ревматоидному васкулиту. Особенно часто иммунные комплексы встречаются при синдроме Фелти.
2.Инфекционные заболевания. Инфекции, вызванные живыми возбудителями, представляют собой сильный антигенный стимул, на который организм отвечает соответствующими иммунными реакциями. Вместе с тем иммунные комплексы не всегда элиминируются, а, оставаясь
ворганизме, могут оказывать патогенное действие.
3.Опухолевые заболевания. При иммунопролиферативных заболеваниях положительные реакции могут быть обусловлены как иммунными комплексами, так и неспецифически агрегированными атипичными антителами.
4.Трансплантация. При пересадке органов и тканей часто отмечают повышение уровня циркулирующих иммунных комплексов.
–61 –
Метод основан на феномене гашения флюоресценции при взаимодействии с некоторыми гаптенами. Молекулы антител, облучаемые УФ лучами с длиной волны 280– 295 нм, испускают флюоресцентное излучение с длиной волны 345 нм. Такое соотношение длин волн возбуждающего и эмиссионного излучения характерно для триптофана.
Другие ароматические аминокислоты (тирозин и фенилаланин) также флюоресцируют, но их абсорбционные и эмиссионные максимумы находятся в области еще более коротких длин волн и отличаются малой интенсивностью.
Связывание подходящего лиганда антителами сопровождается переносом энергии возбужденных остатков триптофана на связанный лиганд, что сопровождается исчезновением флюоресценции в типичной области.
Результатом переноса энергии, таким образом, является гашение триптофановой флюоресценции молекул антител. Энергия возбуждения может передаваться внутри молекулы антитела на расстояние Fab-фрагмента, т. е. приблизительно на 5 нм.
Эффективность переноса энергии зависит, во-первых, от ориентации возбужденных остатков триптофана по отношению к связанному лиганду, во-вторых, от степени
– 62 –
перекрывания спектра флюоресценции антитела и спектра поглощения лиганда. Особенно хорошо наблюдается тушение с нитроароматическими лигандами, например, ДНФ и ТНФ.
Полное замещение лигандами участков связывания антител приводит к гашению определенной части общей триптофановой флюоресценции. Эта максимальная степень гашения флюоресценции (Qmax) должна быть определена в эксперименте, поскольку различные параметры антител неоднородны в этом отношении.
Впервом приближении степень гашения флюоресценции зависит от числа «занятых» участков связывания антител. При известной концентрации антител и лиганда по степени гашения Qi / Qmax можно судить о количестве связанного с антителами лиганда (r) и свободного лиганда (с). В настоящей главе этот метод будет рассмотрен применительно к анти-ДНФ-антителам.
Материалы и оборудование 1. спектрофотометр;
2. очищенные специфические анти-ДНФ-антитела;
3. нормальный Ig того же вида;
4. раствор гаптена, например ε-ДНФ-L-лизина.
Постановка опыта
Втермостатируемую кювету флюориметра вносят 1 мл раствора антител. После стабилизации температуры образец облучают УФ светом с длиной волны 280–295 нм и регистрируют интенсивность флюоресценции на длине волны 345 нм. В полученные данные вводят поправку на флюорес-
–63 –
ценцию растворителя. Раствор АТ (антитело) облучают УФ светом только во время измерения флюоресценции. Раствор гаптена добавляют вначале порциями по 10 мкл, затем – по 20 мкл, до тех пор пока объем добавленного гаптена не достигнет 200 мкл. Концентрация ε-ДНФ-L-лизина должна составлять около 10-5 М.
После каждого прибавления гаптена смесь необходимо тщательно перемешивать. Можно наносить раствор гаптена пипеткой на стеклянную палочку с расплющенным концом, который затем переносят в раствор антител и перемешивают. После каждого добавления гаптена измеряют интенсивность флюоресценции (Qi).
Для оценки связывания необходимо определять максимальное гашение флюоресценции (Qmax) для каждого препарата антител. Насыщение участков связывания антител устанавливают титрованием 1 × 10-3 М раствором гаптена. Получаемое при такой концентрации гаптена гашение флюоресценции должно быть откорригировано параллельным титрованием нормального иммуноглобулин. Титрование проводят до молярного избытка гаптена, равного 200 : 1, к участкам связывания AT. При этом практически все участки связывания оказываются «занятыми». Дальнейшее увеличение концентрации гаптена не увеличивает специфического гашения флюоресценции.
Оценка результатов
На рис. 15 представлены кривые титрования для определения Qmax и аффинности анти-ДНФ-кролика.
– 64 –
Рис. 15. Гашение флюоресценции при помощи специфических кроличьих анти-ДНФ-антител при титровании гаптеном – ε-ДНФ-L-лизином (Ковальчук Л. В., 2011)12
Справа: титрование двух различных препаратов АТ (антитело) с целью определения их аффинности.
Слева: определение максимального гашения флюоресценции (Qmax = 70 %). Неспецифическое гашение вследствие высоких концентраций гаптена корригируется параллельным титрованием с нормальным lgG.
12Ковальчук, Л. В. Клиническая иммунология и аллергология
сосновами общей иммунологии / Л. В. Ковальчук, Л. В. Ганковская, Р. Я. Мешкова. – М. : ГЭОТАР-Медия, 2011. – 640 с.
–65 –
Количество связанного гаптена после каждой добавки рассчитывается по следующей формуле:
где Qi – гашение флюоресценции после внесения соответствующего гаптена; b – количество связанного гаптена; АК – молярная концентрация антител; n – число участков связывания на молекулу AT; Qmax – максимальное гашение флюоресценции при полном связывании антител гаптеном.
При помощи b рассчитывают молярное соотношение связанного гаптена с антителами r. Количество свободного гаптена с равно разности количеств добавленного гаптена и связанного гаптена b. Определение истинной средней константы ассоциации проводят по уравнению Сипса.
Оценка метода
Изучение гашения флюоресценции при оценке аффинности АТ (антитело) имеет по сравнению с другими описанными методами то преимущество, что оно требует очень малого количества антител, оно в 100–10 раз меньше, чем необходимо при использовании других методов. Титрование не занимает много времени, приблизительно 15 минут.
Также становится возможным исследование АТ (антитело) в экстремальных условиях (температура, рН, ионная сила, влияние макромолекул), приводящих к денатурации белков при длительном воздействии.
– 66 –
К числу недостатков метода следует отнести неудобства, связанные с использованием высокоочищенных антител и ограниченного круга гаптенов.
Наилучшие результаты до настоящего времени получены при работе с нитрофенильным гаптеном. Данные, полученные методом гашения флюоресценции, менее точны, чем при равновесном диализе, поскольку определение аффинности основано на вторичном феномене связывания гаптена антителами.
– 67 –
1.ВИЗУАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ПОЛОЖИТЕЛЬНОГО РЕЗУЛЬТАТА В МЕТОДЕ РАДИАЛЬНОЙ ИММУНОДИФФУЗИИ ОСНОВАНА НА
1)образовании агглютининов
2)повышении прозрачности среды
3)растворении клеток
4)образовании колец преципитации в геле
2.ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ГУМОРАЛЬНОГО ЗВЕНА ИММУНИТЕТА НЕ ВКЛЮЧАЕТ ВЫПОЛНЕНИЕ СЛЕДУЮЩИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ТЕСТОВ
1)уровени антител в сыворотке крови и других биологических жидкостях
2)содержание Т-лимфоцитов в периферической крови
3)уровень циркулирующих иммунных комплексов
4)относительное и абсолютное содержание B- лимфоцитов
3.ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ГУМОРАЛЬНОГО ЗВЕНА ИММУНИТЕТА НЕ ВКЛЮЧАЕТ ВЫПОЛНЕНИЕ СЛЕДУЮЩИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ТЕСТОВ
1)уровени антител в сыворотке крови и других биологических жидкостях
–68 –
2)содержание т-лимфоцитов в периферической крови
3)уровень циркулирующих иммунных комплексов
4)относительное и абсолютное содержание B-лим- фоцитов
4.КАКОЙ БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЕЙ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ПРИ ОЦЕНКЕ ИММУННОГО СТАТУСА
1)цельная периферическая кровь
2)спинномозговая жидкость
3)синовиальная жидкость
4)сыворотка крови
5.УКАЖИТЕ КЛАСС ИММУНОГЛОБУЛИНОВ, В НОРМЕ ИМЕЮЩЕГО НАИБОЛЬШЕЕ СОДЕРЖАНИЕ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
1)Ig A
2)Ig D
3)Ig E
4)Ig G
6.К КАКОМУ ТИПУ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ОТНОСИТСЯ РАДИАЛЬНАЯ ИММУНОДИФФУЗИЯ
1)реакция агглютинации
2)реакция лизиса
3)реакция преципитации
4)РСК
–69 –