Laboratornye_metody_ocenki_gumoralnogo_zvena_immuniteta_ Belan_E_B2021
.pdf
При использовании метода CIA к раствору, содержащему интересующее нас анализируемое соединение (обозначим его как А), добавляют определенное того же, но ХЛ-меченого соединения (обозначим его как А*) и антитела (анти-А). Образуется смесь меченых и немеченых иммунных комплексов (рис. 12).
Рис. 12. Схема иммунохемилюминесцентного анализа
(Resende E. A., 2007)9
Очень важно то, что пропорция между меченым и немеченым иммунными комплексами зависит от того, сколько
9 Assessment of basal and gonadotropin-releasing hormonestimulated gonadotropins by immunochemiluminometric and immunofluorometric assays in normal children / E. A. Resende, B. H. Lara, J. D. Reis [et al.] // J Clin Endocrinol Metab. – 2007. – Vol. 92 (4). – P. 1424 – 1429.
– 50 –
меченого антигена было добавлено (А*). И сколько немеченого находилось в исследуемой пробе (А), а именно чем больше немеченого антигена, тем меньше меченых антител. Теперь остается очистить смесь иммунных комплексов и определить количество А*, анти-А по хемилюминесценции. Интенсивность ХЛ будет тем меньше, чем больше было немеченых антигена А (то есть, анализируемого вещества) в исследуемой пробе.
При использовании метода ICMA (ИХЛ) берут избыток ХЛ-меченого антигена (анти-А*) и добавляют к нему раствор с изучаемым веществом (А), при этом образуется ХЛ-меченый иммунный комплекс. Интенсивность ХЛ будет тем выше, чем больше анализируемого вещества А в пробе. В обоих случаях для количественного анализа используют калибровочные кривые.
Таким образом, хемилюминесцентный иммунный анализ (используемый в современной клинической лабораторной диагностике) обладает большей чувствительностью и специфичностью (аналитическая чувствительность – 1021 моль, по сравнению с иммуноферментным анализом – 107 моль), занимает меньше времени на исследование и практически сравним по специфичности и чувствительности с радиоиммунологичесим методом, за счет применения активаторов, ХЛ-меток, ускоряющих иммунологическую реакцию.
Преимущество ИХЛА состоит в следующем:
простота исследования;
минимальное время получения результата исследо-
вания;
–51 –
возможность полной автоматизации процесса и наличие высококачественных реагентов.
Для регистрации реакции хемилюминесценции возможно использовать как полуавтоматические, так и автоматические анализаторы. Следует отметить, что полуавтоматические анализаторы требуют «вмешательства оператора», однако, начиная с момента введения реакционной смеси в анализатор, все последующие стадии автоматизированы. Оператор (врач-лаборант) проводит подготовку проб и смешивание реагентов, однако очередность внесения бланка, калибраторов или стандартов задана в приборе, выдавая оператору запрос на их исследование и на внесение следующей пробы. Расчет результатов в полуавтоматических анализаторах автоматизирован, результаты подаются на дисплей в заранее запрограммированных оператором единицах. Кроме того, некоторые системы способны оценивать адекватность полученных результатов по бланку, значению, или изменению оптической плотности. В наиболее современных полуавтоматических анализаторах предусмотрена возможность верификации результатов путем построения карт Леви – Дженнингса или сообщение о недостоверности результатов.
Большинство полуавтоматических анализаторов имеют встроенный процессор и дисплей, однако некоторые обладают возможностью подключения к внешним компьютерам или оборудованы стандартным записывающим устройством (дисковод). Вывод результатов осуществляется как на дисплей, так и на принтер, который, в свою очередь, также
– 52 –
может быть встроенным или внешним. В настоящее время существуют полуавтоматические приборы, способные измерить хемилюминесценцию и выразить (оценить) интенсивность специфического свечения не только качественно, но и количественно.
Полуавтоматические аппараты – ридеры ИХЛА существуют в стриповом (например, Lumi Stat) и пробирочном вариантах, со спектральным диапазоном чувствительности
300–650 нм.
Полностью автоматизированные анализаторы осуществляют дозирование реагентов, их смешивание и внесение реакционной смеси в зону анализа автоматически. Контроль оператора требуется только на стадии программирования тестов и при определении «профиля» (регламента последовательности определения тех или иных параметров) и количества анализируемых проб.
Общими чертами всех автоматических анализаторов являются: высокая пропускная способность, малый расход реагента (в сравнении с мануальными методиками и определением на полуавтоматических анализаторах), автоматическая подача и смешивание реагентов (в наиболее современных системах блок для хранения реагентов охлаждается). Практически все автоматические системы оборудованы программным обеспечением, позволяющим оценивать достоверность результатов, кроме того, при получении недостоверного результата они позволяют повторить анализ с другим разведением пробы. В большинстве приборов этого класса управление осуществляется при помощи внешнего
– 53 –
компьютера или аналогичного современным компьютерным системам встроенного процессора. Основными критериями выбора того или иного анализатора являются его аналитические возможности и математическое обеспечение (специализированное программное обеспечение).
Автоматические приборы ИХЛА являются более эффективными, удобны в работе с высоким качеством результатов, и в то же время выполняют такие исследования быстро в течение 15–20 минут. Обычно такие аппараты обрабатывают значительное количество (180–480) анализов с возможностью измерения экстренных образцов, добавления реактивов и расходных материалов без остановки основного режима. Таким образом, для автоматических ИХЛ приборов характерно:
1)простота выполнения исследований;
2)экономическая целесообразность (за счет исключения дополнительных расходов по использованию контролей и калибраторов);
3)достоверность результатов.
Как правило, это «закрытые» системы, выполняющие широкий диапазон исследований: от инфекций до эксклюзивных гормонов, с использованием одноразовых кювет или чашечек, и, как правило, требующих малых (100– 250 мкл) объемов биологической пробы.
– 54 –
Иммуноблоттинг, или Вестерн-блот, является высокочувствительным методом определения специфических белков, основанным на сочетании методов ИФА и электрофореза (рис. 13).
Вметоде на первом этапе смесь белков разделяется методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), затем переносится на нитроцеллюлозную мембрану методом электроблоттинга. Суть данного метода заключается в том, что гель после электрофореза помещается на нитроцеллюлозную мембрану между слоями фильтровальной бумаги. Собранный таким образом «сэндвич» помещается в электрическое поле так, что комплексы бе- лок-ДСН движутся поперек пластины геля и иммобилизуются (в результате неспецифической сорбции) на поверхности нитроцеллюлозной мембраны.
Всвязывании комплекса белок-ДСН с нитроцеллюлозной мембраной принимают участие в основном силы электрической природы, причем данное взаимодействие является многоточечным и приводит к «распластыванию» белков на поверхности мембраны. Таким образом, после электропереноса мы получаем на нитроцеллюлозе реплику геля с белками, расположенными так же, как и в полиакриламидном геле.
После переноса белков мембрану инкубируют последовательно с антителами, специфичными к исследуемому белку, а затем со вторичными антителами, специфичными
–55 –
к Fc-фрагментам первичных антител, конъюгированными с ферментной меткой. В случае, когда с меткой конъюгированы непосредственно первичные, специфичные к исследуемому антигену антитела, вторичные антитела не требуются. Образовавшиеся в месте локализации исследуемого белка иммунные комплексы «проявляются» с помощью хромогенного субстрата.
Рис. 13. Схема Вестерн-блот теста (Zampieri S., 2000)10
Для визуализации результата взаимодействия связанного с мембраной антигена и антител используют вторичные антитела, конъюгированные с агентами, способными в определенных условиях давать определенный сигнал.
10 The use of Tween-20 in immunoblotting assays for the detection of autoantibodies in connective tissue diseases / S. Zampieri,
A.Ghirardello, A. Doria [et al] // J Immunol Methods. – 2000. – Р. 239.
–56 –
Обычно в качестве такого агента используют фермент (пероксидазу или фосфатазу), продукт реакции которого имеет окраску и выпадает на мембране в виде нерастворимого осадка (рис. 14).
Рис. 14. Визуализация результатов Вестерн-блот теста
(Rumlova M., 2014)11
Применение метода:
Иммуноблот широко используется для подтверждения наличия в организме антител к возбудителям инфекций, когда первичный анализ с использованием других методов
11HIV-1 protease-induced apoptosis / M. Rumlová, I. Křížová, A. Keprová [et al.] // Retrovirology. – 2014.
–57 –
дает положительный или сомнительный результаты. Например, иммуноблот используется для подтверждения теста на наличие антител к ВИЧ. Кроме того, метод часто применяют с целью определения наличия или отсутствия в крови антител к различным белкам клеточных ядер организма. Это позволяет более точно устанавливать вид аутоиммунного заболевания у человека, у которого ранее были выявлены антитела к смеси белков ядер клеток.
– 58 –
Образование комплексов «антиген-антитело» (иммунных комплексов) – естественная иммунологическая реакция здорового организма, направленная на выведение чужеродного антигена и сохранение гомеостаза. При ревматологических, аутоиммунных, аллергических заболеваниях, а также инфекциях различной этиологии и новообразованиях отмечается повышение содержания ЦИК.
Известны следующие способы определения ЦИК в биоматериале:
Антигенспецифические, основанные на выявлении ЦИК с известным антигеном за счет различий между свободным и связанным с антителами антигеном. В настоящее время они не нашли широкого применения, так как в большинстве случаев антиген, входящий в состав ЦИК, неизвестен или трудно определим.
Антигеннеспецифические методы. Нашли наибольшее распространение в клинических исследованиях и делятся на несколько основных групп:
Основанные на биологических свойствах иммунных комплексов
1. Определение ЦИК при взаимодействии с комплементом, в частности общей комплементсвязывающей активности (КСА), реакции с Clqили C3b-субкомпонентами
– 59 –