Laboratornye_metody_ocenki_gumoralnogo_zvena_immuniteta_ Belan_E_B2021

Радиоиммунный анализ, РИА (radioimmunoassay, RIA) – высокочувствительный метод детектирования следовых количеств субстанций, основанный на совместном использовании радиоизотопно меченых антител и иммунологической реакции «антитело – антиген».

Радиоиммунный анализ основанный на реакции «антиген – антитело» (АГ-АТ), один из компонентов которой несет радиоактивную метку, позволяет обнаруживать как антигены, так и антитела и определять их концентрацию в исследуемой пробе.

АГ или АТ для РИА метят радиоактивным изотопом, чаще всего изотопом йода (I125). Реакции РИА очень чувствительны, позволяют обнаружить 1–2 нг и менее исследуемого вещества. Для их проведения необходима специальная радиометрическая аппаратура.

Известны различные методы модификации РИА, из которых чаще всего применяется твердофазная. Как и при проведении твердофазной ИФА для постановки этой реакции АГ и АТ длительное время сохраняют способность вступать в серологические реакции.

Применяются три метода твердофазного РИА: конкурентный, обратный и непрямой.

При конкурентном методе РИА на поверхности полистироловых лунок сорбируют известные АТ. Затем в лунки вносят исследуемый антигенсодержащий материал и спустя определенное время, достаточное для специфического

– 41 –

Рис. 11. Схема твердофазного радиоиммунологического анализа

при определении неизвестного АГ с помощью конкурентного

прямого (а) и обратного (б) методов:

1 – известные антитела, специфичные искомому АГ; 2 – меченные изотопом известные АГ; 3 – искомые АГ; 4 – меченные изотопом к искомому АГ;

5 – известный АГ8

В обоих случаях применяются антивидовую меченую сыворотку, содержащую АТ против соответствующих гам- ма-глобулинов. Для проведения серологической диагностики с помощью непрямого метода РИА на поверхности лунок сорбируют АГ, а затем добавляют разведенную сыворотку больного. При наличии в ней соответствующих АТ на поверхности лунок формируется комплекс АГ-АТ. При последующем внесении в лунки меченной изотопом антивидовой сыворотки АТ, содержащиеся в ней, адсорбируются

8Ковальчук, Л. В. Клиническая иммунология и аллергология

сосновами общей иммунологии / Л. В. Ковальчук, Л. В. Ганковская, Р. Я. Мешкова. – М. : ГЭОТАР-Медия, 2011. – 640 с.

–43 –

на образовавшемся комплексе АГ-АТ (роль АГ в данном случае выполняют человеческие АТ-гамма-глобулины). Чем больше в сыворотке больного АТ, тем больше будет связанной с поверхностью лунок радиоактивной метки. Определение радиоактивности в жидкой фазе содержимого лунок позволяет судить о количестве АТ в сыворотке больного.

Этот метод очень широко используется в лабораторной диагностике. С помощью РИА в биологических жидкостях определяют концентрации гормонов, факторов роста, ферментов, аутоантител, маркеров злокачественных новообразований и других веществ (например, лекарственных средств и наркотиков).

Принцип метода

В основе РИА лежит феномен конкуренции: связывание антител с антигеном, меченным радиоактивным изотопом, подавляется в присутствии немеченного антигена.

Методика РИА включает следующие основные этапы:

1.К раствору антител добавляют меченный антиген и пробу (содержащую неизвестное количество немеченного антигена). Концентрацию антител в реакционной смеси подбирают так, чтобы число мест связывания было намного меньше общего числа антигенов. Концентрация меченного антигена должна превышать максимальную возможную концентрацию антигена в пробе.

2.Реакционную смесь инкубируют при определенной температуре. Меченный и немеченный антигены конкурентно связываются с антителами, при этом образуются иммунные комплексы, содержащие либо меченный, либо

–44 –

немеченный антиген. Таким образом, к концу инкубации в реакционной смеси присутствуют меченные и немеченные иммунные комплексы, а также свободные меченные и немеченные антигены. Количество меченных иммунных комплексов обратно пропорционально количеству немеченного антигена в пробе.

Чтобы оценить количество меченных иммунных комплексов, их надо отделить от свободного меченного антигена. Наиболее распространены два способа разделения:

1)к реакционной смеси добавляют вещество, повышающее ее плотность, например ПЭГ (полиэтиленгликоль);

2)к реакционной смеси добавляют вещество с большой молекулярной массой, которое специфически связывается с антителами в составе иммунных комплексов. Для этого используют вторые антитела либо стафилококковый белок A.

В обоих случаях иммунные комплексы, имеющие большую молекулярную массу, чем свободные антигены, осаждают центрифугированием и измеряют радиоактивность осадка.

3. Определяют концентрацию антигена в пробе по калибровочной кривой. Для ее построения используют несколько стандартных калибровочных растворов с известными концентрациями немеченного антигена.

Оценка результатов

В отличие от биологических методов анализа, РИА является количественным иммунохимическим методом и дает возможность точно измерить содержание вещества

–45 –

(антигена) в пробе. Результат РИА зависит только от соотношения компонентов реакции «антиген – антитело».

Условия надежности результата РИА

1.При разведении пробы измеренная концентрация вещества должна уменьшаться пропорционально степени разведения.

2.Кривая зависимости уровня связывания антител

смеченным антигеном от концентрации антигена в пробе должна совпадать с калибровочной кривой.

Если эти условия не выполняются, можно предположить, что на иммунохимическую реакцию влияют факторы, перечисленные ниже. Надо отметить, что правильно интерпретированный результат РИА может иметь диагностическое значение, даже если он не удовлетворяет формальным критериям надежности (например, из-за иммунохимических различий между стандартом и пробой).

Факторы, неспецифически влияющие на иммунохимическую реакцию

1.pH. Скорость реакции «антиген – антитело» и стабильность иммунных комплексов обычно не зависят от pH в интервале 7,0–8,5. Как правило, в очень кислой или очень щелочной среде иммунные комплексы диссоциируют, хотя некоторые белки с основными свойствами лучше всего взаимодействуют с антителами при pH 4,0–6,0. Поэтому для каждой системы РИА подбирают оптимальный pH.

2.Состав реакционной смеси также влияет на реак-

цию «антиген – антитело». Энергия взаимодействия антигена с антителом уменьшается при высокой концентрации

–46 –

солей в пробе или в реакционной смеси. Некоторые лекарственные средства (гепарин) и бактерицидные препараты (тиомерсал) подавляют иммунохимическую реакцию. Поэтому для разведения стандартов и проб используют один и тот же буферный раствор и учитывают возможные эффекты компонентов реакционной смеси.

Чувствительность и специфичность РИА

Чувствительность РИА очень высока. Некоторые методики выявляют очень низкие концентрации веществ, такие, как 10–14 моль/л. Чувствительность особенно важна при измерении базальных концентраций пептидных гормонов (эти концентрации обычно находятся в пределах от 10-13 до 10-10 моль/л), а также при определении гормонов непептидной природы, наркотиков и лекарственных средств, ферментов, бактериальных и вирусных антигенов.

Специфичность РИА определяется специфичностью антител и может быть чрезвычайно высокой. Получены антитела и разработаны методики РИА, позволяющие дифференцировать антигены с малейшими структурными различиями, в том числе:

1)T3 и T4 (различаются одним атомом йода);

2)кортизол и кортикостерон (различаются одним гидроксильным радикалом);

3)инсулины человека и свиньи (различаются концевой аминокислотой B-цепи);

4)инсулины свиньи, кашалота и собаки (имеют одинаковую последовательность аминокислот, но разную конформацию).

–47 –

Одним из современных методов лабораторной диагностики иммунологического профиля является хемилюминесцентный иммуноанализ (CIA) и иммунохемилюминисцентный (ICMA) анализ. По идеологии хемолюминесцентный иммунный анализ не отличается от радиоиммунного анализа, с той лишь разницей, что вместо радиоактивно-меченых субстратов или антител, используют субстраты и антитела, меченные соединением, которое вступает в реакции, сопровождающиеся хемилюминесценцией в присутствии перекиси водорода и катализатора (обычно это фермент пероксидаза). Низкая интенсивность собственной хемилюминесценции в результате длительных исследований для аналитических целей была преодолена добавлением определенных соединений, так называемых активаторов (усилителей).

Химические активаторы хемилюминесценции – это соединения, вступающие в химические реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии. Наблюдаемое при этом свечение связано с переходом молекул в основное состояние, что приводит к высвечеванию фотонов. Известными активаторами хемилюминесценции является люминол (3-аминофталевый гидразид), люцегенин и другие. Под действием окислителя (радикала гидроксила) происходит образование радикала люминола, который вступает в реакцию

– 48 –

с супероксидным радикалом, образуя внутреннюю перекись (диоксид). Её разложение приводит к образованию возбужденной молекулы 3-аминофталата. Переход этой молекулы в основное состояние сопровождается испусканием кванта света. В присутствии активаторов все молекулы субстрата передают энергию электронного возбуждения на молекулы активатора, и интенсивность свечения определяется квантовым выходом люминесценции активатора, который

видеале приближается к единице; интенсивность свечения увеличивается на 3–4 порядка, то есть, это ферментативноусиленная хемилюминесценция. Хемилюминесцентными метками (ХЛ-метками) чаще всего служат низкомолекулярные соединения, по химической структуре близкие люминолу и люциногену, такие как изолюминол, сукцинированный люминол, эфиры акридия и другие. Присоединение хемилюминесцентной метки производится либо к антигену, то есть, к низкомолекулярному соединению, либо к комплементарному (специфичному) антителу на этот антиген. В первом случае, метод называется CIA (Chemiluminiscent Immuno Assay), во втором – ICMA (ImmunoChemiluminoMetric Assay).

Таким образом, используют иммунологическую реакцию, где в качестве субстрата присоединяют люминофоры, т. е. вещества, обладающие свечением в ультрафиолете и уровень свечения измеряется специальным прибором – люминометром. Эти методы направлены на определение биологически важных низкомолекулярных соединений в тех концентрациях (как правило, очень низких) в которых они встречаются

вбиологических объектах.

–49 –