Laboratornye_metody_ocenki_gumoralnogo_zvena_immuniteta_ Belan_E_B2021
.pdf
Метод исследования и анализа вещества, основанный на измерении интенсивности светового потока, рассеиваемого взвешенными частицами данного вещества, образующимися в результате реакции антиген-антитело.
Интенсивность рассеянного светового потока зависит от множества факторов, в частности от концентрации частиц в анализируемой пробе. Большое значение при нефелометрии имеет объём частиц, рассеивающих свет. Важное требование к реакциям, применяемым при нефелометрии, заключается в том, что продукт реакции должен быть практически нерастворим и представлять собой суспензию (взвесь). Для удержания твёрдых частиц во взвешенном состоянии применяются различные стабилизаторы (например, желатин), предотвращающие коагуляцию частиц.
Принцип метода
Для измерения интенсивности рассеянного света используются специальные приборы – нефелометры. Их действие основано на уравнивании двух световых потоков: одного от рассеивающей взвеси, другого от матового или молочного стеклянного рассеивателя прибора. Один из вариантов нефелометрии – нефелометрическое титрование, в котором раствор анализируемого вещества титруют раствором осадителя. В процессе титрования интенсивность рассеянного света увеличивается пропорционально количеству образующихся частиц. В точке эквивалентности рост помутнения прекращается. По излому кривой титро-
– 30 –
вания находят объём затраченного на реакцию осадителя. Погрешность при этом составляет от 5 до 10 % (рис. 7).
Рис. 7. Нефелометрия. Принцип метода. (Пилипенко А. Т., 1999)6
Применение
Данный метод позволяет с высокой точностью определить уровни IgG, IgA, IgM и подклассов IgG. Кроме того, нефелометрия используется для определения концентрации антигенов, так как при добавлении к ним антител происходит дозазависимое образование иммунных комплексов, рассеивающих проходящий свет. Этот метод подходит для определения белков в низкой концентрации, например IgE, уровень которого
всыворотке не превышает 1 мкг/мл. На сегодняшний день многие современные лаборатории используют нефелометрию
вкачестве стандартного метода (в том числе автоматизированного) количественного определения иммуноглобулинов.
6 Пилипенко, А. Т. Аналитическая химия. В 2 кн.: кн. 1 / А. Т. Пилипенко, И. В. Пятницкий. – М. : Химия, 1999. – 480 с.
– 31 –
Иммуноферментный анализ (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) – лабораторный иммунологиче-
ский метод выявления антигенов и антител, основанный на определении комплекса «антиген – антитело» за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску. Основой проведения любого варианта ИФА служит определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями.
Различают несколько модификаций ИФА:
1.ELISA (enzyme linked immunoadsorbent assay);
2.EIA (enzyme immunoassay);
3.EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique). ELISA и EIA – это методы гетерогенного или твердофаз-
ного анализа, EMIT является гомогенным ИФА. Для определения антигенов и антител применяются твердофазный (гетерогенный) вариант ИФА. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих
– 32 –
в реакции. ИФА основан на двух принципиальных научных открытиях.
Первое заключается в способности ферментов и антител, ковалентно или нековалентно связанных с твердой основой, сохранять свою функциональную активность, то есть расщеплять субстрат (ферменты) и связывать антигены / антитела; второе базируется на создании комплекса «антитело – фермент» (Аb-F) в виде конъюгата, сохраняющего свою биологическую активность в растворе. Аb-F-конъюгаты характеризуются высочайшей специфичностью и чувствительностью, достигающей 97–99 %.
ИФА, по сравнению с другими методами детекции антигенов и антител, обладает следующими преимуществами:
высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл;
возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;
стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более);
простотой проведения реакции;
наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета;
возможностью автоматизации всех этапов реакции;
относительно низкой стоимостью диагностических наборов.
Благодаря своей доступности и экологической безопасности, ИФА перешел в разряд стандартных, «рутинных» анализов.
–33 –
Первичным процессом в ИФА является стадия «узнавания» анализируемого соединения специфическим к нему антителом. Так как процесс образования иммунохимических комплексов происходит в строго количественном соотношении, обусловленном аффинностью, концентрациями компонентов и условиями реакции, то достаточным для определения исходной концентрации анализируемого соединения является количественная оценка образовавшихся иммунных комплексов. Для такой оценки возможно либо прямое определение концентрации образующихся иммунокомплексов (тип 1), либо количественная оценка оставшихся свободными мест специфического связывания (тип 2).
Второй стадией является формирование связи меченного ферментом соединения со специфическим комплексом или свободными центрами связывания.
Заключительным процессом в иммуноферментном анализе является трансформация субстрата под действием ферментной метки в соответствующий сигнал, измеряемый каким-либо анализатором.
Принимая во внимание вышеописанные подходы для определения специфических комплексов, дальнейшую классификацию методов ИФА, можно осуществить по типу реагентов, используемых на первой стадии анализа.
Если на первой стадии в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод является неконкурентным. Для неконкурентного анализа типа 1 оптимальным является соотношение компонентов,
– 34 –
при котором концентрация центров связывания значительно превышает концентрацию определяемого соединения. Необходимым условием для неконкурентного анализа типа 2 является соблюдение соотношения избытка или сравнимой концентрации определяемого соединения (антигена) и мест специфического связывания, так как в этом случае определяется разность общего числа мест связывания и числа образовавшихся иммунных комплексов.
Если на первой стадии анализа в системе одновременно присутствуют анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за имеющиеся в относительном недостатке центры специфического связывания, то метод является конкурентным. Необходимым условием конкурентного метода является недостаток центров специфического связывания по отношению к суммарной концентрации анализируемого соединения и его аналога.
Следующим принципом классификации методов ИФА является их разделение по типу проводимых на каждой из иммунохимических стадий реакций. В соответствии с этим все методы можно разделить на две группы – гомогенные и гетерогенные.
Применение ИФА: Чувствительность ИФА позволяет определить вещества в концентрациях 1,0–0,001 нМ или белок в микрограммах-нанограммах в 1 мл. Подобно тому, как глаз человека регистрирует одиночный световой квант, ИФА можно усовершенствовать так, что он с помощью каскадных
– 35 –
систем усиления позволит обнаруживать одиночные молекулы анализируемого вещества. Возможности увеличения чувствительности ограничиваются фоном анализируемого соединения, (то есть его наличием не только в анализируемом образце, но и в используемых реактивах и растворителях), субстратной специфичностью фермента и аффинностью антител.
К ограничениям ИФА относится также наличие в тестируемых образцах кофакторов, ингибиторов и стимуляторов активности ферментов.
Еще один недостаток – ИФА не позволяет различать нативные белки и их биологически неактивные фрагменты, сохранившие антигенные детерминанты. Помехой для ИФА может быть изменение каталитической активности фермента при его конъюгировании с антигеном. Ограничением ИФА является его применимость лишь к хорошо изученным системам, где есть очищенные антигены и высокоспецифические антитела.
Метод ИФА используется для определения уровня антител при различных инфекционных заболеваниях, а также уровня гормонов, аутоантител и различных маркеров онкологических заболеваний, возможно определение иммуноглобулинов (видовая принадлежность, субклассы, специфичность. Однако следует отметить, что иммуноферментный анализ может давать и ложные результаты.
Ложноположительные могут возникнуть за счет ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека;
– 36 –
за счёт антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов; у новорожденных такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери. Ложноотрицательные результаты реакции обусловлены конкуренцией между иммуноглобулинами М и G, а также техническими ошибками при постановке реакции.
Методика проведения сэндвич-метода ИФА
Реагенты:
исследуемый материал сыворотка или плазма крови;
антитела, адсорбированные на поверхности лунки полистиролового микропланшета;
коньюгат – мышиные моноклониальные антитела, меченые пероксидазой;
тетраметилбензидин (ТМБ) – субстрат;
фосфатно-солевой буфер;
положительный контрольный образец;
отрицательный контрольный образец.
Ход работы:
1.Внесение калибраторов, контрольных и исследуемых сывороток в лунки микропланшета.
2.Инкубация в течение 1 часа при температуре 37 °С.
3.Отмывание лунок от раствора с не связавшимися комплексами.
4.Внесение конъюгата в лунки микропланшета, включая лунки с контролями и калибраторами.
–37 –
5.Инкубация в течение 1 часа при температуре 37 °С.
6.Отмывание лунок.
7.Внесение раствора ТБМ в лунки микропланшета, включая лунки с контролями и калибраторами.
8.Внесение стоп-реагента. Если реакция положительная раствор в лунках микропланшета желтеет (рис. 8).
Рис. 8. Микропланшет для ИФА. Окраска растворов в лунках
соответсвует концентрации искомого аналита
Учёт ИФА проводят на основании оптической плотности, полученной с помощью фотометра. Концентрация искомого вещества определяется на основании построенной калибровочной кривой и находится в прямой или обратной зависимости от значения оптической плотности
(рис. 9, 10).
– 38 –
Рис. 9. Схема постановки непрямого ИФА (Ковальчук Л. В., 2011)7
Применение:
ИФА широко используется в массовой диагностике инфекционных заболеваний; определении уровня гормонов; количественной оценке разных классов антител; выяв-
7Ковальчук, Л. В. Клиническая иммунология и аллергология
сосновами общей иммунологии / Л. В. Ковальчук, Л. В. Ганковская, Р. Я. Мешкова. – М. : ГЭОТАР-Медия, 2011. – 640 с.
–39 –