Laboratornye_metody_ocenki_gumoralnogo_zvena_immuniteta_ Belan_E_B2021
.pdfвают равным 6,1 с помощью 10%-го раствора лимонной кислоты. Перед употреблением эритроциты быка 3–4 раза отмывают фосфатным буфером и готовят 0,5%-ю (по объему) взвесь клеток.
Подготовка и учет реакции розеткообразования
Реакцию проводят по методу, описанному Jondal и соавт. в 1972 г. В пластиковые пробирки (от 2 до 5) вносят 0,1 мл взвеси лимфоцитов и добавляют равный объем 0,5%-й взвеси эритроцитов быка. Соотношение эритроциты: лимфоциты не должно превышать 50 : 1. Инкубируют смесь в термостате 37 °С в течение 10 мин. Затем пробы центрифугируют 5 мин при 1 000 об./мин (для ЦЛК-1) и оставляют на ночь в холодильнике при температуре 4 °С. Подсчет клеток мы рекомендуем проводить в камере Горяева.
Существующий метод фиксации суспензии глютаровым альдегидом с последующим приготовлением мазков и просчетом розеток в окрашенных препаратах позволяет накапливать стекла и анализировать результаты реакций в другой, свободной от постановки или менее загруженный, день. Однако глутаровый альдегид изменяет поверхность эритроцитов быка, вызывает неспецифическое прилипание их к клеткам крови человека. Не исключено, что глутаровый альдегид десеквестрирует скрытые антигены в мембране бычьих эритроцитов, к которым имеются рецепторы у лимфоцитов человека. Более перспективен в этом плане ацетальдегид, фиксация которым эритроцитов стандартизирует определение В-лимфоцитов и делает возможным обоснованное сопоставление результатов, полученных разными лабораториями.
– 20 –
Для просчета клеток в камере Горяева осадок клеток в извлеченных из холодильника пробирках осторожно ресуспендируют пастеровской пипеткой (несколько раз медленно набирают и выпускают клеточную взвесь) и добавляют 0,02 мл 0,01%-го раствора в фосфатном буфере акридинового оранжевого. Этот краситель дает ярко-зеленую люминесценцию при возбуждении ультрафиолетом. Через 2–3 мин заполняют камеру Горяева и определяют процент Е-РОК путем подсчета 300 лимфоцитов в люминесцентном микроскопе. Это значительно облегчает и ускоряет процедуру счета ярко светящихся лимфоцитов, окруженных розоватыми эритроцитами.
В день взятия крови на В-лимфоциты необходимо проводить общий анализ крови, который дает возможность высчитывать абсолютные значения Т-клеток.
– 21 –
Принцип РРГ заключается в том, что при взаимодействии с антителами сенсибилизированных вирусным антигеном эритроцитов барана в присутствии комплемента происходит лизис эритроцитов. Суспензию бараньих эритроцитов обрабатывают диагностикумом, отмывают и вносят в расплавленный агарозный гель, одновременно добавляя туда комплемент. После перемешивания гель тонким слоем наливают на стеклянную пластину и после затвердения вырезают в нем лунки диаметром 2 мм. В лунки наливают по 5 мкл исследуемой сыворотки (предварительно прогретой для удаления, содержащегося в них комплемента). Диффундируя через гель, антитела образуют комплекс с антигеном и комплементом на поверхности эритроцитов, следствием чего является лизис. Вокруг лунок образуется прозрачная зона гемолиза, диаметр которой прямо пропорционален концентрации специфических антител.
Анализируемые образцы:
В качестве биоматериала в методике используются пробы сывороток или плазмы крови (с добавлением цитрата, гепарина, ЭДТА) человека и животных, полученные стандартными лабораторными методами. В отдельных случаях для анализа можно использовать асцитные жидкости животных, освобожденные от опухолевых клеток.
Оборудование и материалы:
рН-метр;
весы торсионные;
– 22 –
дозаторы переменного объема;
наконечники для дозаторов;
чашки Петри диаметром 100 мм;
стаканы химические мерные или колбы мерные вместимостью 100 мл, 1 000 мл;
вода дистиллированная.
Реагенты:
фосфатный буферный раствор pH 7,2–7,3;
боратный буферный раствор pH 9,00;
эритроциты барана;
комплемент;
агарозный гель.
Проведение анализа РРГ:
В лунки вносят по 5 мкл исследуемых образцов, а так-
же контрольные образцы: К+ и К–. Чашку закрывают крышкой и выдерживают при температуре от 2 до 8 °С в течение 18–20 ч, а затем при температуре от 36 до 38 °С в течение
1,5–2,5 ч.
Параллельно с основным опытом ставят контрольный опыт на агарозной пластинке с несенсибилизированными эритроцитами для исключения неспецифического гемолиза. Подготовку эритроцитов для контрольного опыта проводят так же, как для основного, но их не соединяют с диагностикумом.
Учет результатов РРГ
Результаты учитывают визуально, просматривая чашки Петри в проходящем свете при снятой крышке. Положительный результат, свидетельствующий о наличии специ-
– 23 –
фических антител в исследуемых образцах и положительном контрольном образце – прозрачная зона гемолиза диаметром не менее 4 мм вокруг лунки, в центре которой иногда остаются нелизированные эритроциты. Отрицательный результат – полное отсутствие зоны гемолиза вокруг лунки с сывороткой.
Реакцию считают специфичной, если положительный и отрицательный контроли показали соответствующие результаты. При этом в контрольном опыте с несенсибилизированными эритроцитами гемолиза быть не должно. Причиной неспецифического гемолиза может быть не стерильность сывороток, для исследования таких сывороток рекомендуется добавлять в них 1%-й раствор борной кислоты в количестве 1–2 капли на 2–4 мл сыворотки.
РРГ является высокочувствительным тестом. С помощью данного метода IgG выявляются спустя годы после заболевания.
Область применения:
1.Клиническая вирусология. Например, для подтверждения клинического диагноза у больных с подозрением на клещевой энцефалит исследуют парные сыворотки, полученные на 5–7 и 14–21 дни заболевания.
2.Тестирование иммунотоксичности новых фармакологических препаратов.
3.Производство иммунобиологических препаратов.
Втом числе метод полезен для оценки специфической активности препаратов иммуноглобулинов против клещевого энцефалита.
–24 –
Метод основан на феномене преципитации, когда взаимодействие антигенов с антителами в геле сопровождается образованием видимого осадка – преципитата. При постановке реакции используются моноспецифические сыворотки против Ig G, М и А человека. Контрольная сыворотка представляет собой смесь сывороток крови доноров (не менее чем от 500) с известным содержанием иммуноглобулинов. В условиях опыта исследуемые сыворотки вносят в лунки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергированы моноспецифические сыворотки. Размер образующегося кольца преципитации вокруг лунки прямо пропорционален концентрации исследуемого Ig, содержание которого определяют относительно контрольной сыворотки. Количество и соотношение иммуноглобулинов отдельных классов в биологических жидкостях отражают состояние В-клеточного иммунитета.
В предварительных опытах определяют оптимальное (рабочее разведение антисывороток к иммуноглобулинам каждого класса. В каждом опыте устанавливают количество иммуноглобулинов стандартной сыворотки и по отношению
– 25 –
к ней определяют количество иммуноглобулинов в исследуемом материале.
Методика радиальной иммунодиффузии по Манчини
Впредварительных опытах определяют оптимальное (рабочее разведение антисывороток к иммуноглобулинам каждого класса. В каждом опыте устанавливают количество иммуноглобулинов стандартной сыворотки и по отношению к ней определяют количество иммуноглобулинов в исследуемом материале.
Используют 3%-й агар Дифко на веронал-мединаловом буфере pH 7,3–7,4 (мединал – 35,4 г, веронал – 5,25 г, дистиллированная вода – до 1 000 мл). В бактериологической пробирке смешивают по 5 мл расплавленного агара и антисыворотки. Берут два стекла размером 9 × 12 см, на одно из них помещают П-образную рамку, сверху кладут второе стекло. Толщина рамки составляет 1 мм. В щель между стеклами заливают смесь агара и антисыворотки и оставляют
ввертикальном положении для застывания агара на 15– 20 мин. Затем удаляют одно из стекол и рамку.
Вагаре пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм (5 рядов по 7 лунок в каждом). В лунки первого ряда вносят разведения стандартной сыворотки, в остальные – исследуемые пробы по 1 мкл. Пластинку выдерживают во влажной камере 24 ч (IgG, IgA) или 48 ч (IgM).
Строят калибровочную кривую. На оси абсцисс откладывают значения диаметров колец преципитации разведенной стандартной сыворотки, на оси ординат – значения концентраций иммуноглобулинов (% или мг/мл) (рис. 5).
–26 –
Рис. 5. Интерпретация результатов РИД по Манчини. (Воробьев А. А., 2003)4
Измеряют диаметр колец преципитации в пробах и по калибровочной кривой устанавливают концентрацию соответствующего иммуноглобулина. В некоторых случаях при учете результатов отмечается образование двойных колец преципитации, что связано с присутствием в исследуемой сыворотке парапротеинов. Появление парапротеинов у больных наблюдается при миеломной болезни (L-цепи Ig – белки Бенс-Джонса), моноклональный IgМ является признаком макроглобулинемии Вандельстрема.
4 Воробьев, А. А. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии : учебное пособие / А. А. Воробьев. – М. : Медицинское информационное общество, 2003. – 236 с.
– 27 –
В 1948 г. Орьян Оухтерлони (Orjan Ouchterlony) и независимо от него Стефан Элек (Stephen Elek) опубликовали разработанную ими методику двойной, или встречной, иммунодиффузии, то есть диффузии антител и антигенов навстречу друг другу в геле. Эти исследователи обнаружили и использовали физико-химические свойства агарового геля, поры которого имеют размеры, достаточные, чтобы пропустить молекулы свободных антител и многих растворимых антигенов, но задерживающие более крупные по размеру комплексы антител с антигенами. В результате
вместе встречи антител с антигенами выпадает осадок;
вгеле он виден невооруженным глазом как полоса преципитации.
Ход реакции:
1.Агар растворяют в физиологическом растворе при 56 °С (температура расплавления агара).
2.В виде золя агар выливают на плоское стекло. При охлаждении до комнатной температуры агар застывает
вгель.
3.В застывшем геле пробивают трубочкой-пробой- ником правильные круглые отверстия (лунки) небольшого диаметра (~2–3 мм).
4.В эти лунки вносят образцы антисыворотки и растворы антигенов.
–28 –
5. Оставляют на диффузию в течение 16–24 ч, по истечении которых можно наблюдать полосы преципитации, если в исследуемых образцах присутствовали комплементарные друг другу лиганды (рис. 6).
Рис. 6. Метод Оухтерлони и Элека: а – линии преципитации, при
диффузии двух одинаковых антигенов (АГ) навстречу антителам (АТ),
плавно сливающиеся друг с другом; б – линии преципитации,
при диффузии двух разных антигенов навстречу антителам,
не сливающиеся, а пересекающиеся между собой, «не замечающие»
друг друга. (Воробьев А. А., 2007)5
5 Воробьев, А. А. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии : учебное пособие / А. А. Воробьев. – М. : Медицинское информационное общество, 2003. – 178 с.
– 29 –