Laboratornye_metody_ocenki_gumoralnogo_zvena_immuniteta_ Belan_E_B2021
.pdf
Процесс активации В-клеток происходит посредством их стимуляции двумя сигналами:
1.Антигеном, вступающим во взаимодействие с антигенраспознающим поверхностным рецептором В-лимфоцита.
Вкачестве такого рецептора выступает мономерная форма IgМ, встроенная в мембрану наивного В-лимфоцита и ассоциированная со специальными вспомогательными белками
(Igα и β).
2.Цитокинами, вырабатываемыми Т-хелперами. При этом необходимо непосредственное взаимодействие β-лим- фоцита с Т-хелпером соответствующей специфичности. Достигается такое взаимодействие между В-клеткой и Т-хелпером благодаря частичному преобразованию патогена внутри В-лимфоцита и последующей презентации его в иммуногенной форме Т-хелперу. Таким образом, антигенраспознающий рецептор В-лимфоцита, образованный мономерным IgМ, с одной стороны, служит для распознавания специфического антигена, а с другой, – выступает в качестве молекулярного фактора захвата антигена и переноса его в цитоплазму В-лимфоцита.
– 10 –
Помимо определения относительного и абсолютного содержания В-клеток в периферической крови, очень важно дать качественную оценку их функциональной активности. С использованием метода многоцветной проточной цитофлуориметрии, по наличию тех или иных маркеров можно оценить функциональную активность В-лимфоцитов.
СD 19, CD20, CD22 – основные маркеры, используемые в настоящее время для идентификации В-клеток.
В различных клинических ситуациях могут представлять интерес следующие рецепторы:
CD5 – молекула адгезии, регулирует активацию клеток. Определяется на Т-лимфоцитах, тимоцитах, В1-клоне В-клеток;
CD23 – экспрессируется на активированных В клетках, макрофагах, клетках тимического эпителия, эозинофилах, тромбоцитах. Участвует в индукции клеточного деления;
CD25 – a-цепь рецептора ИЛ2. Экспрессируется на различных типах клеток периферической крови, в том числе на В-лимфоцитах. CD27 – дополнительный маркер В2-лимфоцитов. Указывает на переход В-лимфоцитов из наивных клеток в клетки памяти;
CD38 – отсутствует на зрелых В-клетках человека, но обнаруживается на конечной стадии дифференцировки
плазматических клеток и клеток центров размножения,
атакже на В-клетках очень ранних стадий созревания.
–11 –
HLA-DR – экспрессируется различными клетками периферической крови. Определяется на всех В-лимфоцитах
имоноцитах, на активированных Т-лимфоцитах (маркер поздней активации).
Кроме того, к маркерам активации В-клеток относятся:
высокоаффинный рецептор для ИЛ-2 и другие рецепторы для факторов роста и дифференцировки, таких как ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6;
мембранные антигены МНС класса II;
рецепторы трансферрина.
Среднее содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови приведено в таблице.
Среднее содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови у разных возрастных групп
Возраст |
Концентрации иммуноглобулинов |
||||
|
|
в сыворотке крови, г/л |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
IgM |
|
IgG |
|
IgA |
|
|
|
|
|
|
3 года |
0,5–2 |
|
4–11 |
|
0,2–1,5 |
|
|
|
|
|
|
4–5 лет |
0,4–2 |
|
4,5–12,5 |
|
0,25–1,5 |
|
|
|
|
|
|
6–8 лет |
0,5–2 |
|
6,3–13 |
|
0,3–2 |
|
|
|
|
|
|
9–10 лет |
0,5–2,5 |
|
6–16 |
|
0,45–2,5 |
|
|
|
|
|
|
Взрослые |
0,55–3,5 |
|
6,5–13,5 |
|
0,7–3,15 |
|
|
|
|
|
|
– 12 –
Принцип метода
Принцип метода проточной цитометрии основан на регистрации флюоресценции, которая образуется при взаимодействии антигена с меченым с помощью флюорохрома антителом, и светорассеяния от каждой отдельно взятой клетки в клеточной суспензии. Суспензия клеток под давлением подается в проточную ячейку, где за счет разности давлений между образцом и обтекающей жидкостью клетки, находясь в ламинарном потоке жидкости, выстраиваются в цепочку друг за другом за счет, так называемого, гидродинамического фокусирования (рис. 2).
Рис. 2. Принцип работы проточного цитофлуориметра. (Davey H., 2004)2
2Davey, H. Flow cytometry for clinical microbiology / H. Davey
//CLI. – 2004. – № 2/3. – Р. 12 – 5.
–13 –
Клетки одна за другой проходят через лазерный луч, а высокочувствительные детекторы, расположенные вокруг проточной ячейки, регистрируют флюоресценцию и рассеяное лазерное излучение каждой клетки. Полученный сигнал передается в компьютер, обрабатывается, и полученные данные отображаются в виде различных графиков и гистограмм (рис. 3).
Рис. 3. Данные анализа проб методом проточной цитофлуориметрии
(Loken M. R.,1999)3
Пробоподготовка образцов
В качестве образцов для исследования на проточном цитометре могут использоваться различные суспензии
3 Loken, M. R. Immunofluorescence Techniques in Flow Cytometry and Sorting. – 2nd ed. / M. R. Loken // Wiley. –1999. – Р. 341 – 353.
– 14 –
клеток и биологические жидкости. Для проведения исследования на проточном цитометре необходимо минимизировать количество частиц в исследуемой суспензии, которые могут затруднить анализ. Чаще всего такими частицами являются эритроциты в образцах крови или костного мозга, тогда как объектом исследования выступают лейкоциты.
Получение лейкоцитарной суспензии возможно несколькими способами:
лизис эритроцитов химическим агентом, разрушающим мембрану эритроцита (например, 0,9%-й раствор хлорида аммония);
центрифурирование пробы на градиенте плотности (например, выделение мононуклеарной фракции из крови при помощи центрифугирования на фиколле).
В случае, если объектом исследования является культура клеток, данный этап пробоподготовки, как правило, пропускается. Для контроля потери клеток в процессе пробоподготовки рекомендуется параллельно с исследованием на проточном цитометре производить подсчет лейкоцитарной формулы под микроскопом.
Применение проточной цитометрии
Проточная цитометрия применяется для анализа образцов, включая периферическую кровь, аспират костного мозга, биоптаты, в том числе, с использованием тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ), биопсии свежей ткани и всех жидкостей организма.
– 15 –
В настоящее время метод не используется, но представляет интерес с точки зрения биологических свойств В-лимфоцитов.
Принцип метода
Поверхностные рецепторы, специфичные для различных субпопуляций лимфоцитов, проявляются, связывая эритроциты, нативные или нагруженные антителами к этим рецепторам. Эритроциты образуют с поверхностью лимфоцита фигуру, называемую розеткой. За розетку принимают лимфоцит, присоединивший 3–5 эритроцитов. В ряде случаев эритроциты плотно окутывают лимфоцит, образуя так называемую морулу. Интерпретация этого феномена крайне разноречива. Нередко он отражает методические неточности постановки. Феномен розеткообразования может быть усилен путем обработки эритроцитов нейраминидазой (рис. 4).
Рис. 4. Схема розеткообразования с эритроцитами барана
– 16 –
Принцип метода
В-лимфоциты имеют рецепторы для эритроцитов быка, которые выступают, таким образом, специфическим маркером для их распознавания (Е-РОК: Erythrocyte – розеткообразующие клетки).
Приборы и оборудование:
центрифуга ЦЛК-1;
холодильник (бытовой);
термостат;
микроскоп люминесцентный (МЛ-2 или другие типы);
камера Горяева;
счетчик клеток;
автоматические пипетки или микропипетки;
пробирки силиконированные или пластиковые;
штатив для пробирок.
Реактивы:
среда 199, раствор Хенкса;
гепарин (готовят раствор из расчета 25 ЕД/мл крови);
фосфатный буфер рН 7,4;
0,01%-й раствор акридинового оранжевого;
0,1%-й раствор эозина, 0,1%-й раствор трипанового синего на дистиллированной воде;
гипак (изопак, верографин, уротраст);
–17 –
фиколл 400 (полисахарид с молекулярной массой
400 000);
эритроциты быка.
Ход определения:
10 мл крови из локтевой вены вносят в пластиковую пробирку с раствором гепарина (256 ЕД/мл) и осторожно перемешивают. Гепаринизированную кровь разводят фосфатным буфером рН 7,4 в соотношении 1 : 2; 9 мл смеси осторожно наслаивают на раствор фиколл-гипак плотности 1,077 г/мл (12 частей 9%-го фиколла и 5 частей 33,9%-го гипака плотности 1,077 г/мл). Пробирки центрифугируют
40мин при 1 500 об./мин.
Всвязи с тем, что могут использоваться разные системы центрифуг, необходимо применять такие режимы центрифугирования, чтобы сила разделения в интерфазе составила 400 g. Величину центробежного ускорения G вычисляют по формуле:
G = 1,1 × n2 × R – 10-5,
где n – число оборотов в минуту; R – радиус от центра оси
центрифуги до границы соприкосновения смеси фиколлгипака с разделяемой суспензией в см.
После центрифугирования слой лимфоцитов осторожно пипеткой извлекают из интерфазы и дважды отмывают буферным раствором.
Концентрацию клеток доводят до 2–4 млн в 1 мл в «среде 199», содержащей 10%-й раствор телячьей сыворотки или сыворотки IV (АВ) группы крови человека. При использовании последней необходима инактивация при 56 °С
– 18 –
втечение 30 мин и абсорбция эритроцитами. Для этого 0,5 мл осадка отмытых эритроцитов добавить к 1 мл сыворотки и инкубируют в течение 1 ч при 37 °С, периодически встряхивая.
Можно использовать любой буферный раствор рН 7,0– 7,2 без ионов Ca++ (наличие ионов Ca++ способствует конгломерации клеток, их коагуляции).
Желательна абсорбция сыворотки пулом лейкоцитов, учитывая возможность наличия антилейкоцитарных антител. При использовании человеческой сыворотки необходимо учитывать влияние аутоцитолимфотоксинов, проявляющих максимум активности при 4 °С.
Перед использованием суспензии лимфоцитов проверяют их жизнеспособность. Равные объемы 0,1%-го раствора водного эозина на среде Хенкса или Рингера двойной концентрации без глюкозы и 0,1%-го раствора трипанового синего на дистиллированной воде смешивают перед употреблением и 1–2 капли добавляют к капле суспензии клеток и часть смеси переносят в камеру Горяева. Окрашенные (мертвые) клетки просчитывают на 100 клеток в поле зрения. При правильной обработке процент мертвых клеток не превышает 3.
Приготовление эритроцитов быка
Используют эритроциты одного животного или смесь, полученную от нескольких. Эритроциты можно хранить
втечение 2 недель при 4 °С в растворе Олсвера (глюкоза – 2,05 г, цитрат натрия – 0,8 г, хлорид натрия – 0,42 г, дистиллированная вода – 100 мл), рН этого раствора устанавли-
–19 –