ÐÑновнÑе_ÑоÑмÑ_бакÑеÑий_ÐÑÑоение_бÐ

3. Клеточная стенка бактерий – строение и значение. Окраска по Граму, механизм окраски. Примеры грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Основой клеточной стенки бактерий является биополимер – пепти-

догликан (муреин), являющийся плотной структурой.

Значение клеточной стенки:

-придает клетке постоянную форму;

-защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее давление;

-участвует в транспорте метаболитов;

-несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов (вирусов бактерий);

-является мишенью для действия ряда антибиотиков;

По строению клеточной стенки различают грамположительные и гра-

мотрицательные бактерии, их дифференцируют с помощью окраски по Граму. Отношение к окраске по Граму является важнейшим тинкториальным признаком, который учитывают при идентификации бактерий.

Окраска по Граму (рис. 16):

-окрашивают генциан-фиолетовым;

-окрашивают раствором Люголя;

-обесцвечивают 96о спиртом;

-промывают водой, окрашивают фуксином Пфейффера;

-промывают водой, высушивают и микроскопируют.

31

Рис. 16 – Алгоритм окраски по Граму.

Механизм окраски по Граму.

Дифференцировка на грамположительные и грамотрицательные бакте-

рии зависит от строения клеточной стенки (рис. 17), основой которой являет-

ся пептидогликан. У грамположительных бактерий толщина пептидогликана

50 нм, у грамотрицательных – не более 20 нм.

Рис. 17 – Строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий

32

При окрашивании препарата генциан-фиолетовым, а затем раствором Люголя, образуется комплекс генциан-фиолетовый + йод. Все клетки окра-

шиваются в сине-фиолетовый цвет. При обработке спиртом у грамположи-

тельных бактерий образовавшийся комплекс не обесцвечивается. Поэтому при окрашивании фуксином Пфейффера они сохраняют сине-фиолетовый цвет. У грамотрицательных бактерий комплекс генциан-фиолетовый + йод обесцвечивается спиртом и при окраске фуксином Пфейффера они приобре-

тают розово-красный цвет.

В результате окраски бактерии дифференцируют на грамположительные

(сине-фиолетовые) или грамотрицательные (розово-красные) (рис. 18).

Рис. 18 – Мазок из смеси бактерий в окраске по Граму: грамположительные S. aureus, грамотрицательные E. coli

К грамположительным относят все кокки (кроме нейссерий), спорообра-

зующие и ветвящиеся бактерии. К грамотрицательным – нейссерии, неспо-

рообразующие бактерии, спириллы.

4. Особенности клеточной стенки кислотоустойчивых бакте-

рий, окраска по Цилю-Нильсену, механизм окраски.

Кислотоустойчивые бактерии имеют особый химический состав кле-

точной стенки с повышенным количеством липидов и жирных миколовых

кислот.

33

К ним относят:

Mycobacterium tuberculosis – возбудитель туберкулеза;

Mycobacterium leprae – возбудитель лепры;

Mycobacterium africanum – возбудитель эндемического туберкулеза в Африке;

Mycobacterium scrofulaceum – возбудитель лимфаденитов у детей;

Mycobacterium smegmatis – нормальный симбионт мочеполовой системы мужчин.

Кислотоустойчивые бактерии плохо воспринимают красители. Для их окраски и дифференцировки от других бактерий используют метод Циля-

Нильсена.

Окраска по Цилю-Нильсену.

- на фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бума-

ги, наносят карболовый фуксин Циля, над пламенем спиртовки подогревают мазок 2-3 раза до появления пара;

- бумагу снимают, препарат обесцвечивают 5% раствором серной кисло-

ты;

-промывают водой, окрашивают метиленовым синим;

-промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, кислото-

податливые – в синий.

Механизм окраски по Цилю-Нильсену:

При обработке препарата карболовым фуксином Циля все клетки окра-

шиваются в красный цвет. При последующем обесцвечивании серной кисло-

той кислотоустойчивые бактерии из-за особенностей своего химического со-

става удерживают краситель. Кислотоподатливые – обесцвечиваются, поэто-

му при дальнейшем окрашивании метиленовым синим воспринимают краси-

тель и приобретают синий цвет (рис. 19).

34

Рис. 19 – Окраска по Цилю-Нильсену (А – M. tuberculosis в мокроте, В –

M. leprae в ткани)

5. L-формы бактерий, их медицинское значение. Микоплазмы.

L-формы (от названия Института им. Д. Листера, где они впервые были изучены) – это бактерии, полностью или частично утратившие клеточную стенку, но способные к размножению. Имеют своеобразную морфологию в виде крупных и мелких сферических клеток.

L-трансформации могут подвергаться все бактерии, имеющие клеточ-

ную стенку.

L-трансформация происходит под действием различных индуцирую-

щих факторов (лизоцим, разрушающий пептидогликан, антибиотики, угне-

тающие биосинтез клеточной стенки и др.). В результате бактерии становятся устойчивыми к некоторым антибиотикам.

L-трансформация может быть обратимой и необратимой. Обратимая –

наблюдается при сохранении генов, кодирующих синтез клеточной стенки, и

тогда бактерии возвращаются в исходную форму.

L-формы могут образовывать многие возбудители инфекционных забо-

леваний. Это одна из причин хронизации заболеваний и форм приспособле-

ния бактерий к неблагоприятным условиям существования.

35

МИКОПЛАЗМЫ (УРЕАПЛАЗМЫ) – бактерии, лишенные клеточной стенки. Ее функции выполняет цитоплазматическая мембрана. В отличие от других бактерий, микоплазмы быстрее погибают в неблагоприятных услови-

ях и устойчивы к действию бактериофагов (вирусов бактерий).

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

1. С помощью преподавателя освоить технику приготовления мазка.

Этапы приготовления мазка:

1.Собственно приготовление мазка.

-на обезжиренном предметном стекле обвести границу мазка маркером по стеклу;

-приготовление мазка из жидкой питательной среды: прокалить петлю.

При работе с одноразовыми стерильными петлями прокаливание не тре-

буется. Над спиртовкой открыть пробку пробирки, обжечь края пробирки,

набрать каплю культуры петлей. Снова обжечь края пробирки и закрыть пробкой. Пробирку поставить в штатив, нанести каплю культуры на предметное стекло и распределить петлей параллельными движениями

(диаметр мазка – 0,5-1см). Прокалить петлю (при работе с одноразовыми петлями, они сразу помещается в дезинфицирующий раствор);

-приготовление мазка с плотной питательной среды: прокалить петлю

(при работе с одноразовыми стерильными петлями прокаливание не тре-

буется). Над спиртовкой открыть пробирку с физиологическим раство-

ром, обжечь края пробирки и набрать петлей каплю физиологического раствора. Снова обжечь края пробирки и закрыть пробкой. Нанести кап-

лю на предметное стекло. Затем прокалить петлю (при работе с одноразо-

выми стерильными петлями прокаливание не требуется). Над спиртовкой открыть пробирку с плотной питательной средой, обжечь края пробирки.

Споверхности плотной среды взять петлей немного культуры бактерий,

снова обжечь края пробирки и закрыть пробкой. Внести культуру в каплю

физ. раствора, распределить микробную взвесь параллельными движени-

36

ями (диаметр мазка – 0,5-1см). Прокалить петлю (при работе с одноразо-

выми петлями, они сразу помещается в дезинфицирующий раствор).

2.Высушить мазок высоко над пламенем спиртовки.

3.Фиксировать мазок жаром. Для этого стекло 3 раза внести в среднюю треть пламени спиртовки на 1-2 секунды. Приступить к окрашиванию мазка.

2.Приготовленные мазки окрасить простым методом: метиленовым синим –

1мин, фуксином Пфейффера – 30 сек. Промыть мазки водой и высушить фильтровальной бумагой, микроскопировать.

3.Приготовить мазки из смеси культур S. epidermidis и E. coli. Окрасить по Граму.

Окраска по Граму:

−на фиксированный мазок нанести генциан фиолетовый на 2 мин.;

−нанести раствор Люголя на 1 мин., краситель слить;

−нанести 960 этиловый спирт на 10-15 сек.

−промыть мазок водой и докрасить фуксином Пфейффера 30 сек.;

−промыть водой, высушить фильтровальной бумагой, микроскопировать.

4. Изучить технику окраски препарата по Цилю-Нильсену для выявления кислотоустойчивых (вакцинный штамм туберкулезных палочек (BCG)) и

кислотоподатливых (стафилококки) микроорганизмов.

Окраска по Цилю-Нильсену:

−на фиксированный мазок положить полоску фильтровальной бумаги, нанести небольшое количество карболового фуксина Циля;

−нагреть мазок над пламенем спиртовки 2-3 раза до появления пара, не доводя до кипения;

−снять бумагу, дать препарату остыть и нанести 5% раствор серной кислоты на 1-2 мин. (для обесцвечивания);

−мазок промыть водой и докрасить метиленовым синим 3-5 минут.

В результате окраски вакцинный штамм туберкулезных бактерий при-

обретает красный цвет, а стафилококки – синий.

37

Занятие №3

Тема. Строение бактериальной клетки. Спорообразование у бактерий и его значение.

Цель занятия. Изучить строение бактериальной клетки, процесс спорообра-

зования у бактерий.

I.Теоретические знания:

1.Оболочечные структуры бактериальной клетки: капсула (капсульный слой), клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана.

2.Цитоплазма, ее составные: нуклеоид, плазмиды, рибосомы, мезосомы,

включения.

3.Поверхностные структуры бактериальной клетки: жгутики, пили.

4.Спорообразование у бактерий.

II.Практические навыки:

1.Световая микроскопия демонстрационных препаратов.

38

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

Основные структуры бактериальной клетки (рис. 20):

оболочечные структуры: капсула, клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана (ЦПМ);

цитоплазма;

органеллы: нуклеоид, плазмиды, рибосомы, мезосомы

поверхностные структуры: жгутики, пили

Рис. 20 – Строение бактериальной клетки

1.Оболочечные структуры бактериальной клетки: капсула

(капсульный слой), клеточная стенка, цитоплазматическая

мембрана.

Снаружи многие бактерии имеют КАПСУЛЬНЫЙ СЛОЙ (МИКРО-

КАПСУЛУ) – слизистое образование, не превышающее диаметр бактери-

альной клетки. У некоторых бактерий имеется ИСТИННАЯ КАПСУЛА –

слизистый слой, превышающий диаметр бактериальной клетки. Капсула не

39

является обязательной структурой. У большинства бактерий она имеет поли-

сахаридную природу. У некоторых (Bacillus anthracis) – состоит из белка.

Большинство бактерий образуют капсулу только в макроорганизме

(in vivo):

Streptococcus pneumoniaе – возбудитель крупозной пневмонии;

Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы;

Clostridium perfringens – возбудитель газовой гангрены;

Francisella tularensis – возбудитель туляремии;

Yersinia pestis – возбудитель чумы.

Некоторые бактерии образуют капсулу в макроорганизме и на питатель-

ной среде (in vivo и in vitro):

Klebsiella pneumoniaе – возбудитель пневмонии;

Klebsiella oxytoca – возбудитель сепсиса, инфекций мочевыводящих путей;

Klebsiella granulomatis – возбудитель паховой гранулемы.

Функции капсулы:

-в макроорганизме защищает бактерии от фагоцитоза и действия анти-

тел;

-во внешней среде предохраняет бактерии от высыхания.

Капсулу выявляют в окраске по Бурри-Гинсу. В результате окраски бак-

терии красного цвета, вокруг них бесцветные капсулы на черно-розовом фоне (рис. 21).

Рис. 21 – K. pneumoniaе. Чистая культура. Окраска по Бурри-Гинсу

40