ÐÑновнÑе_ÑоÑмÑ_бакÑеÑий_ÐÑÑоение_бÐ

Требования к осуществлению контроля биологической безопасности в

бактериологических лабораториях

кафедры микробиологии и вирусологии №1

Основные задачи:

1)предотвращение внутрилабораторных заражений сотрудников и обучаю-

щихся;

2)предотвращение внутрилабораторной контаминации (загрязнения посто-

ронними микробами) во время микробиологического исследования;

3)предупреждение распространения инфекций за пределы лаборатории.

Основные требования:

1.Работа в учебной микробиологической лаборатории обязательно прово-

дится в халатах, шапочках, сменной обуви, без украшений на руках. Ру-

кава халата должны прикрывать одежду, волосы следует полностью за-

крывать шапочкой.

2.В помещении лаборатории необходимо соблюдать чистоту и порядок. На лабораторном столе не должно быть посторонних предметов. Во время работы необходимо соблюдать тишину, быть максимально сосредоточен-

ным и внимательно слушать объяснения преподавателя.

3.Все предметы, которые были использованы при работе с микроорганиз-

мами (петли, пипетки, предметные стекла, питательные среды и др.),

должны быть сразу же обеззаражены, либо переданы для автоклавирова-

ния.

4.В конце работы необходимо привести в порядок рабочее место, обрабо-

тать руки дезинфицирующим раствором.

4. Систематика и номенклатура микробов.

В биологической классификации живых организмов, в том числе микро-

бов, самый верхний (крупный) уровень группировки организмов в системе –

это домен. Он включает в себя одно или несколько царств.

11

Домены и входящие в них царства микроорганизмов:

Микроорганизмы (бактерии, вирусы, грибы, одноклеточные простейшие) систематизированы по их сходству, различиям и взаимоотношениям между собой. В основе систематики лежит филогенетический принцип, основанный на эволюционно сформировавшихся генотипических и обусловленных ими фенотипических различиях микроорганизмов.

Систематика включает три части: классификацию, таксономию (расположение, порядок) и идентификацию.

Основой идентификации микроорганизмов являются их морфологические, тинкториальные (восприимчивость красителей), физиологические (культуральные), биохимические, молекулярно-биологические и генотипические свойства. Существующие царства разделены на типы, классы, порядки, семейства, роды и виды (например, вид Escherichia coli принадлежит к роду

Escherichia семейству Enterobacteriaceae порядку Enterobacteriales классу Gammaproteobacteria типу Proteobacteria, царству Bacteria).

5. Основные методы микробиологической диагностики инфек-

ционных заболеваний.

Принципиально методы микробиологической диагностики можно раз-

делить на прямые и непрямые.

ПРЯМЫЕ направлены на выявление в биологическом материале:

•самого возбудителя – микроскопический, микробиологический методы;

•антигенов возбудителя – экспресс-диагностика;

•генетического материала возбудителя – молекулярно-генетические ме-

тоды.

12

Материал от больного зависит от локализации патологического процесса, например: при пневмонии – мокрота, при поражении почек и мочевыводящей системы – моча, при менингите – ликвор, при сепсисе – кровь и т.д.

НЕПРЯМЫЕ (иммунологические) основаны на выявлении специфи-

ческих иммунологических реакций, формирующихся в организме боль-

ного в ответ на внедрение возбудителя, таких как:

•выработка антител – серологический метод;

•инфекционная аллергия – аллергологический метод.

ПРЯМЫЕ МЕТОДЫ

МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД в зависимости от возбудителя под-

разделяют:

бактериоскопический – диагностика некоторых бактериальных ин-

фекций (первичный сифилис, острая мужская гонорея, туберкулез и др.);

вирусоскопический – выявление при использовании светового мик-

роскопа характерных включений, которые образуются в пораженных клет-

ках при некоторых вирусных инфекциях (цитоплазматические включения

Бабеша-Негри при бешенстве, гигантские клетки с внутриядерными включе-

ниями, напоминающие «совиный глаз» при цитомегаловирусной инфекции

(ЦМВИ) (рис. 1).

Рис. 1 – Вирусоскопическое исследование среза слюнных желез при ЦМВИ

13

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД в зависимости от возбудителя

подразделяют:

бактериологический – посев материала от больного с подозрением на бактериальную инфекцию на искусственные питательные среды с целью обнаружения и идентификации возбудителя, а также определения чувстви-

тельности выделенного возбудителя к антибактериальным препаратам. Ис-

пользуют для диагностики холеры, брюшного тифа, дизентерии, туберкулеза,

пиелонефрита и др.;

вирусологический – заражение материалом от больного с подозре-

нием на вирусную инфекцию куриных эмбрионов (диагностика гриппа),

культур клеток (диагностика аденовирусной инфекции, полиомиелита), лабо-

раторных животных (диагностика бешенства, клещевого энцефалита). Затем проводят идентификацию обнаруженного вируса;

микологический – посев материала от больного с подозрением на грибковую инфекцию на соответствующие питательные среды с последую-

щей идентификацией микроскопических грибов и определением чувстви-

тельности к противогрибковым препаратам.

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА – установление диагноза инфекционно-

го заболевания на основании выявления антигенов возбудителя в материале от больного с помощью серологических реакций. Широко используют при ряде заболеваний, а также для быстрой диагностики особо опасных инфек-

ций – чумы, холеры, сибирской язвы.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ подразделяют:

- полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на определении в ис-

следуемом материла не самого микроорганизма, а определенного участка его нуклеиновой кислоты. Для этого необходимо синтезировать молекулярный зонд – праймер, комплементарный этому участку. Если ДНК микроба есть в

14

исследуемом материале, то данный участок становится матрицей для соеди-

нения с праймером. Чтобы обнаружить, что праймер «нашел» эту матрицу,

необходимо увеличить количество копий участка «матрица + праймер» с по-

мощью фермента ДНК-полимераза. В результате нарабатывается достаточ-

ное количество нуклеиновой кислоты для ее визуального обнаружения (де-

текция). Варианты детекции: электрофоретический, флуоресцентный. В

настоящее время используют ПЦР с флуоресцентнтной детекцией – ПЦР в реальном времен (Real-Time PCR). Таким образом, ПЦР обнаруживает мик-

роб по его нуклеиновой кислоте даже в крайне малой ее концентрации и яв-

ляется чрезвычайно чувствительной реакцией.

ПЦР может быть качественной и количественной. Существует мульти-

плексная (мультипраймерная) ПЦР, которая позволяет одномоментно опре-

делять нуклеиновые кислоты нескольких возбудителей. Кроме того, ПЦР применяют для выявления мутаций, ответственных за формирование лекар-

ственной устойчивости возбудителя.

В настоящее время ПЦР широко применяется для диагностики многих инфекционных заболеваний. Особенно актуально использование ПЦР для выявления труднокультивируемых микроорганизмов (возбудителей вирус-

ных гепатитов, SARS-CoV-2, сифилиса, ВИЧ-инфекции, туберкулеза, хлами-

диозов).

- секвенирование – анализ нуклеотидных последовательностей микро-

организмов, в частности, для выявления мутаций, обусловливающих устой-

чивость к антимикробным препаратам.

Метагеномные исследования. Метагеномика – изучает генетический материал (метагеном) сообществ микроорганизмов в биопробах от больного,

в объектах окружающей среды и т.д. в совокупности. Цель метагеномики – получение и анализ всех геномов для установления видового состава и мета-

болических взаимосвязей в микробном сообществе. Проводится определение нуклеотидных последовательностей хромосомных генов микробов, кодиру-

ющих 16S p РНК. Эта РНК входит в состав меньшей субъединицы бактери-

15

альной рибосомы, а гены, которые ее кодируют, практически не подвергают-

ся изменениям в ходе эволюции (т.е. являются в высокой степени консерва-

тивными). Такой метод генетической идентификации позволяет определить фенотипическую принадлежность микроорганизмов, является основой гено-

систематики и позволяет определить степень родства организмов.

БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД – обнаружение возбудителя путем зара-

жения материалом от больного лабораторных животных. Используют для ди-

агностики ботулизма. Кроме того, этот метод применяют для создания экспе-

риментальных моделей инфекционных заболеваний.

НЕПРЯМЫЕ МЕТОДЫ

СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД (от лат. serum – сыворотка и logos –

учение) – определение в сыворотке крови больного антител к конкретному возбудителю инфекционного заболевания с помощью серологических реак-

ций. Используют для диагностики бруцеллеза, туляремии, ВИЧ-инфекции и др.

АЛЛЕРГОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД – определение состояния аллер-

гии – повышенной чувствительности макроорганизма к микробным аллерге-

нам с помощью внутрикожных проб:

-проба Манту с туберкулином при туберкулезе;

-проба Бюрне с бруцеллином при бруцеллезе;

-проба с тулярином при туляремии;

-проба с антраксином при сибирской язве.

6.Размеры и основные формы бактерий.

По размеру бактерии подразделяют:

мелкие (1-3 мкм);

средние (3-6 мкм);

крупные (> 6 мкм).

16

Основные формы бактерий:

1.Шаровидные – кокки.

2.Палочковидные.

3.Извитые.

4.Ветвящиеся.

КОККИ

В зависимости от расположения в мазке кокки подразделяют на микро-

кокки, диплококки, тетракокки, сарцины, стрептококки, стафилококки:

микрококки (от греч. micros – малый) – в мазке располагаются одиночно;

диплококки (от греч. diplos – двойной) – в мазке располагаются попарно.

Диплококки могут быть:

- бобовидной формы:

Neisseria gonorrhoeae – возбудитель гонореи (рис. 2);

Neisseria meningitidis – возбудитель менингококковой инфекции (рис. 3).

- ланцетовидной формы:

Streptococcus pneumoniaе – возбудитель крупозной пневмонии (рис. 4);

тетракокки (от греч. tetra – четыре) – располагаются в мазке по четыре;

сарцины (от греч. sarcio – связываю) – располагаются пакетами по 8-16

клеток:

Sarcina ventriculi – нормальный симбионт желудка.

Тетракокки и сарцины, как правило, не вызывают заболеваний у челове-

ка.

стрептококки (от греч. streptos – цепочка) – располагаются в мазке це-

почкой:

Streptococcus pyogenes – возбудитель скарлатины, рожи, ревматизма и др.

(рис. 5);

Peptostreptococcus anaerobius – нормальный симбионт организма чело-

века, может быть причастен к анаэробной инфекции;

17

Рис. 6 – S. aureus. Чистая культура. Окраска по Граму

ПАЛОЧКОВИДНЫЕ БАКТЕРИИ

Классифицируют на неспорообразующие и спорообразующие.

неспорообразующие палочковидные бактерии:

Psеиdomonas aeruginosa – синегнойная палочка, возбудитель госпитальной инфекции;

Escherichia coli – кишечная палочка, нормальный симбионт толстого кишечника (рис. 7);

Vibrio choleraе – возбудитель холеры – изогнутые в виде запятой палочки (рис. 8).

спорообразующие палочковидные бактерии классифицируют на бациллы и клостридии в соответствии с размером споры (см. занятие №3):

Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы;

19

Clostridium perfringens – возбудитель газовой гангрены;

Clostridium tetani – возбудитель столбняка;

Clostridium botulinum – возбудитель ботулизма.

ИЗВИТЫЕ

Взависимости от количества и характера завитков их подразделяют:

спириллы (от греч. speira – завиток) – бактерии, имеющие изгибы, рав-

ные одному или двум оборотам спирали. При микроскопии имеют форму буквы S или крыльев летящей чайки:

Spirillum volutans– сапрофит;

Campylobacter coli, Campylobacter jejuni – возбудители кишечного кам-

пилобактериоза;

Helicobacter pylori – причастен к возникновению хронического гастрита,

язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, рака желудка (рис.

9);

Рис. 9 – H. pylori. Чистая культура. Окраска по Граму

спирохеты – (греч. speira – завиток, chaite – волосы) имеют штопорооб-

разную форму. Отличаются друг от друга по характеру первичных и вто-

ричных завитков. Первичные завитки – изгибы самой цитоплазмы, вто-

ричные завитки образуются при движении спирохет.

Медицинское значение имеют три рода спирохет (рис. 10):

-трепонемы – (греч. trepo – вращаться, nemo – нить) имеют мелкие

равномерные первичные завитки:

20