Ðведение_в_виÑÑÑоÐогиÑ_2023

двукратные разведения типовых гриппозных диагностических сывороток до разведения 1/320. К этим разведениям добавляют 0,25 мл вируссодержащей жидкости и смеси оставляют для контакта на 30-40 минут при комнатной температуре. После этого во все лунки вносят по 0,5мл 1% взвеси куриных эритроцитов.

Контроли реакции: контроль сыворотки (0,5мл сыворотки + 0,5мл эритроцитов) и контроль эритроцитов (0,5мл физ. раствора + 0,5мл эритроцитов).

Учет реакции через 1-2 часа (табл. 6).

Таблица 6 – Схема учета РТГА

Заключение о типе вируса сделайте самостоятельно.

б) индикация и индентификация вирусов, культивируемых в культуре клеток Нер-2.

III этап исследования: учет цитопатогенного действия (ЦПД) исследуемого вируса на культуру клеток Нер-2.

Под малым увеличением микроскопа отмечают дегенерацию клеток, свидетельствующую о размножении вирусов. Монослой разрушен, оставшиеся клетки округлые, без отростков, с темной зернистой цитоплазмой.

С целью идентификации вирусов производят постановку РН в культуре клеток с аденовирусными диагностическими сыворотками к вирусам 3, 4 и 7 типов, т.к. они наиболее часто вызывают заболевания у людей.

Для постановки РН в три пробирки стерильной пипеткой вносят аденовирусные диагностические сыворотки 3, 4, 7 типов в объеме 0,2 мл. К каждой из этих сывороток добавляют другой стерильной пипеткой по 0,2 мл исследуемой вируссодержащей жидкости. Смеси оставляют для контакта на 1 час, затем каждой смесью в объеме 0,2 мл заражают флаконы с культурой клеток и добавляют по 0,8 мл среды 199.

Контроли реакции: контроль культуры клеток; контроль сывороток (культура клеток + смесь сывороток 3, 4, 7 типов); контроль вируса (культура клеток + вируссодержащая жидкость). Все флаконы (опытные и контрольные) помещают в термостат при температуре 370С на 48-72 часа.

IV этап исследования: учет РН в культуре клеток (табл. 7).

31

Таблица 7 – Схема учета РН в культуре клеток

Вконтроле культуры клеток и контроле смеси сывороток – монослой из нормальных клеток, т.е. отсутствует дегенерация.

Вконтроле вируса – дегенерация клеток за счет ЦПД исследуемого вируса.

Вопытных флаконах монослой из нормальных клеток остается в том флаконе, где произошла нейтрализация вируса, т.е. тип сыворотки совпал с типом инфицирующего агента.

Заключение о типе вируса сделайте самостоятельно.

2. Определение фаготипа бактерий (по схеме).

Провести фаготипирование культур микроорганизмов, выделенных от больного и предполагаемого источника инфекции для выявления эпидемиологической цепочки при вспышке инфекционного заболевания. Учет фаготипирования культур S. typhi, выделенных от больных брюшным тифом и брюшнотифозного носителя по демонстрации.

32

Занятие №3

Тема. Генетика и изменчивость бактерий. Антибиотики.

Цель занятия. Изучить генетику и изменчивость бактерий, характеристику и спектр действия антибиотиков. Освоить методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

I.Теоретические знания:

1.Организация генетического материала бактериальной клетки. Факторы внехромосомной наследственности.

2.Виды генетической изменчивости. Использование генной инженерии в меди-

цине.

3.Антибиотики. Классификация антибиотиков по механизму антимикробного действия.

4.Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Осложне-

ния и последствия антибиотикотерапии.

II.Практические навыки:

1.Изучить методику определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений.

2.Определение чувствительности бактерий к антибиотикам диско-

диффузионным методом.

33

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

1.Организация генетического материала бактериальной клетки. Факторы внехромосомной наследственности.

Генетический материал бактериальной клетки представлен хромосом-

ной ДНК с гаплоидным набором генов. Хромосомная ДНК находится в супер-

спирализованной форме в виде кольца.

В бактериях могут присутствовать внехромосомные молекулы ДНК: плаз-

миды, транспозоны, вставочные последовательности.

Хромосомный и внехромосомный генетический материал свободно распо-

лагается в цитоплазме.

Факторы внехромосомной наследственности

Факторы внехромосомной наследственности (плазмиды, транспозоны,

вставочные последовательности) состоят из молекул ДНК, не являются жиз-

ненно важными для бактерий, но придают им новые свойства.

Плазмиды – кольцевидные молекулы ДНК, способные к саморепликации

и несущие от 40 до 50 генов. Они находятся в автономном состоянии в цито-

плазме бактерий и способны к самопереносу из одной клетки в другую при

конъюгации. Плазмиды кодируют свойства, дающие бактерии преимущества

при попадании в неблагоприятные условия существования.

Плазмиды подразделяют на различные категории в зависимости от

свойств, которые они кодируют у бактерий (табл. 8):

Таблица 8 – Классификация плазмид

Подвижные генетические элементы

Транспозоны – подвижные участки ДНК, которые способны перемещать-

ся внутри бактериальной хромосомы или между ДНК бактерий, плазмид и бак-

териофагов («прыгающие гены»). Помимо генов, кодирующих их способность

к перемещению по ДНК, транспозоны могут содержать структурные гены,

обеспечивающие бактерию новыми свойствами (устойчивость к антибиотикам,

токсинопродукция и др.).

Вставочные последовательности или инсерционные элементы (от англ.

insertion sequens – вставочные последовательности) – простейший тип генети-

ческих элементов, мигрирующих между хромосомами, внутри хромосомы,

между хромосомой и плазмидами. Содержат гены, необходимые для их пере-

мещения, новых свойств не кодируют.

Подвижные генетические элементы могут:

-распространять новые гены в популяции бактерий;

-координировать взаимодействие плазмид с хромосомой;

-вызывать изменения генов (мутацию, инактивацию) в местах их внедре-

ния в генетический материал.

Таким образом, внехромосомные молекулы ДНК бактериальной клетки способствуют разнообразным изменениям бактериального генома, появлению новых свойств и эволюционным изменениям микробной популяции в целом.

35

2. Виды генетической изменчивости. Использование генной инженерии в

медицине.

Мутации – это изменения последовательности нуклеотидов в бактериаль-

ной ДНК, которые ведут к изменению или утрате одного или нескольких фено-

типических признаков. Мутации у бактерий происходят с высокой частотой под влиянием очень многих внешних факторов, которые называются мутагена-

ми. Самые частые мутагены: УФ-, γ-лучи (физические), органические и неорга-

нические вещества (химические), транспозоны (биологические). Мутации бы-

вают: точечными (затрагивают один ген) и более протяженными (целый уча-

сток хромосомы). Они могут быть самопроизвольными и вызванными искус-

ственно. Мутации, которые приводят к возникновению новых полезных свойств, обеспечивают выживаемость бактериальных популяции.

Генетические рекомбинации – это передача новых генов от одной клетки к другой с приобретением новых свойств, закодированных в этих генах. Гене-

тические рекомбинации отличаются друг от друга способом попадания в клетку новых генов.

Виды генетических рекомбинаций: трансформация, конъюгация,

трансдукция, фаговая конверсия.

Трансформация – форма генетической изменчивости, при которой бакте-

рия-реципиент поглощает из внешней среды трофическим путем фрагменты ДНК погибшей бактерии-донора. Это приводит к образованию рекомбинант-

ных бактерий, обладающих некоторыми свойствами донорских клеток (рис. 10).

36

Рисунок 10 – Трансформация у бактерий (схема)

Впервые феномен трансформации был установлен Ф. Гриффитсом в

1928 г. на модели бескапсульного и капсульного пневмококков (рис. 11). Сле-

дует напомнить, что капсула пневмококков – мощный фактор патогенности,

способствующий возникновению септического течения инфекции и гибели ла-

бораторного животного. Для проведения опыта в качестве индикатора исполь-

зовали 3 белые мыши. Первую мышь заражали живыми, бескапсульными неви-

рулентными пневмококками. Второй мыши вводили убитую культуру капсуль-

ных вирулентных пневмококков; третьей мыши – смесь живых бескапсульных пневмококков и убитых капсульных пневмококков.

В результате из всех мышей, взятых в опыт, погибала третья мышь, т.к.

живые бескапсульные пневмококки поглощали фрагменты ДНК убитых кап-

сульных, приобретали ген, кодирующий синтез капсулы, превращались в виру-

лентные пневмококки и убивали мышь.

37

Рисунок 11 – Опыт Ф. Гриффитса по трансформации пневмококков

Конъюгация – передача генетического (хромосомного и нехромосомного)

материала от бактерии-донора к бактерии-реципиенту при их непосредствен-

ном контакте (рис. 12). Необходимым условием для конъюгации является нали-

чие у бактерии-донора F-плазмиды, которая контролирует синтез половых pili

на поверхности клеток-доноров.

Рисунок 12 – Конъюгация у бактерий (а – электронная микроскопия, б – схема)

Процесс конъюгации между бактерией-донором (F+) и бактерией-

реципиентом (F-) имеет следующие стадии:

•установление контакта между донором и реципиентом с помощью половых pili;

38

•прохождение генетического материала через канал половой pili от донора к реципиенту;

•рекомбинация между донорской и реципиентной ДНК.

F-плазмида может находиться как в автономном состоянии в цитоплазме,

так и в интегрированном с хромосомой клетки. Находясь в автономном состоя-

нии, она контролирует только собственный перенос при конъюгации. В резуль-

тате F- клетка превращается в F+ клетку, содержащую F-плазмиду и способную к конъюгации. Если F-плазмида интегрирована с хромосомой бактерии, то при конъюгации она контролирует не только собственный перенос, но и перенос части хромосомной ДНК в клетку-реципиент. С помощью интегрированной F-

плазмиды частота переноса хромосомных генов между бактериями существен-

но возрастает.

Трансдукция – перенос небольшого фрагмента хромосомной ДНК от клетки-донора к клетке-реципиенту с помощью умеренного бактериофага (рис. 13). В результате трансдукции бактерия-реципиент приобретает новые феноти-

пические признаки (ферментативные свойства, устойчивость к антибиотикам и др.). При выходе бактериофага из клетки-реципиента, фрагмент донорской трансдуцированной ДНК остается в хромосоме клетки, следовательно, сохра-

няются и новые фенотипические признаки. Таким образом, при трансдукции умеренный бактериофаг выполняет только транспортную функцию.

Рисунок 13 – Трансдукция у бактерий

39

Фаговая конверсия (от лат conversion – превращение) – получение бакте-

рией новых свойств в результате использования генов профага, интегрирован-

ного с бактериальной хромосомой. Например, ДНК умеренного дифтерийного фага содержит ген, который кодирует синтез дифтерийного экзотоксина (ген tox). Если ДНК такого умеренного фага интегрируется с ДНК дифтерийной па-

лочки, то она превращается в токсигенную, т.е. продуцирующую дифтерийный экзотоксин. При выходе из клетки умеренного фага дифтерийные бактерии утрачивают ген tox и теряют способность к продукции экзотоксина. Лизогенная конверсия выявлена также у возбудителей ботулизма, холеры и др.

Использование генной инженерии в медицине

•Получение живых вакцин. В основе лежит принцип аттенуации, предложен-

ный Л. Пастером. Аттенуация – ослабление вирулентности микробов под действием физических, химических или биологических факторов с сохране-

нием их иммуногенных свойств. Например, вакцинный штамм туберкулез-

ных бактерий (БЦЖ) был получен А.Ш. Кальметом и Ж-М.К. Жереном пу-

тем длительного (13 лет) культивирования возбудителя туберкулеза на пита-

тельной среде с желчью.

•Получение генно-инженерных вакцин (рекомбинантная дрожжевая вакцина против вирусного гепатита В содержит протективный HBs-антиген вируса).

•Разработка и внедрение в практику молекулярно-биологических методов ди-

агностики инфекционных заболеваний, например, ПЦР.

•Получение штаммов бактерий и микроскопических грибов с высокой про-

дукцией антибиотиков.

•Получение инсулина, гормонов, интерферона и других биологических ве-

ществ в бактериальных клетках с помощью генно-инженерных методов.

40