Ðведение_в_виÑÑÑоÐогиÑ_2023

•Индикацию вирусов, культивируемых в организме лабораторных живот-

ных, проводят по факту гибели животного. Используют для индикации вируса бешенства.

Методы идентификации вирусов

Идентификацию вирусов проводят по антигенным свойствам с помощью серологических реакций со специфическими диагностическими противовирус-

ными сыворотками. Основными реакциями являются: реакция торможения ге-

магглютинации, РН в культуре клеток или в организме животного, РИФ и ИФА.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА): 2-компонентная, слож-

ная серологическая реакция.

Компоненты реакции: исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг), типо-

вые противовирусные диагностические сыворотки (Ат).

Индикатор реакции: 1% взвесь эритроцитов.

Постановка реакции: готовят разведения диагностических сывороток в лунках полистироловой пластины. К ним добавляют вируссодержащую жид-

кость и оставляют на 30-40 минут при комнатной температуре. Затем в лунки вносят взвесь эритроцитов. Учет реакции проводят через 1-2 часа.

Положительная реакция: тип вируса соответствует типу сыворотки. Ви-

русный гемагглютинин блокируется антителами сыворотки, поэтому агглюти-

нация эритроцитов отсутствует. Визуально в лунках определяется осадок

эритроцитов с ровными краями, в виде «пуговицы».

Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки. Ви-

русный гемагглютинин склеивает эритроциты. Визуально в лунках определяет-

ся осадок эритроцитов с неровными краями в виде «перевернутого зонти-

ка».

РТГА применяют для идентификации вирусов гриппа и др., имеющих в суперкапсидной оболочке фермент гемагглютинин.

РН в культуре клеток: 2-компонентная, сложная серологическая реакция.

21

Компоненты реакции: исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг), типо-

вые противовирусные диагностические сыворотки (Ат).

Индикатор реакции: культура клеток.

Постановка реакции: вируссодержащую жидкость смешивают в пробирках со специфическими диагностическими сыворотками. Оставляют на 1 час при комнатной температуре. Затем содержимым пробирок заражают культуры кле-

ток во флаконах.

Положительная реакция: тип вируса соответствует типу сыворотки. Про-

исходит нейтрализация вируса антителами сыворотки – культура клеток оста-

ется нормальной, без изменений. Отрицательная реакция: тип вируса не соот-

ветствует типу сыворотки. Вирус оказывает ЦПД, что приводит к дегенерации

культуры клеток.

РН в культуре клеток применяют для идентификации вирусов полиомие-

лита, аденовирусов и др.

РН можно также использовать для идентификации вирусов, культи-

вируемых в организме лабораторных животных. Компоненты и постановка реакции такие же, как в РН в культуре клеток. Индикатор реакции: лаборатор-

ное животное (в частности, белые мыши).

Положительная реакция: тип вируса соответствует типу диагностической сыворотки, происходит его нейтрализация антителами сыворотки – животное остается здоровым. Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки – животное погибает.

РН в организме животного используется для идентификации вирусов бе-

шенства. В табл. 3 представлены обобщенные данные о методах культивирова-

ния, индикации и идентификации вирусов.

Таблица 3 – Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов

2. Интерфероны, классификация, механизм действия, практическое при-

менение Интерфероны (ИФ) – гликопротеины, которые вырабатываются многими

клетками организма. Однако эта способность наиболее выражена у лейкоцитов,

фибробластов и лимфоцитов. ИФ являются цитокинами, подавляющими раз-

множение вирусов, определенных бактерий и некоторых раковых клеток.

По природе клеток, вырабатывающих ИФ, их делят на три группы:

α-ИФ (лейкоцитарный): обладает выраженным противовирусным действием;

β-ИФ (фибробластный): обладает противовирусным действием, а также регу-

лирует работу лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток (иммуномодули-

рующее действие);

γ-ИФ (иммунный): продуцируется всеми Т-лимфоцитами, стимулирует актив-

ность Т- и В-лимфоцитов, фагоцитов, усиливает синтез молекул MHC I и MHC

II и др. Таким образом, γ-ИФ усиливает активность всех звеньев иммунной

системы.

Механизм противовирусного действия интерферонов.

Интерфероны ингибируют внутриклеточную репликацию широкого спек-

тра ДНК- и РНК-содержащих вирусов.

В инфицированной вирусом клетке синтезируется ИФ, выходит из нее,

связывается с поверхностью здоровой клетки и индуцирует в ней синтез анти-

вирусных белков. Если в эту клетку проникает вирус, то его репродукция по-

давляется этими белками. Один из них является ферментом рибонуклеазой,

которая разрушает мРНК вируса. Второй фермент – протеинкиназа – блокиру-

ет синтез вирусных белков. Репродукция вируса становится невозможной.

Практическое использование интерферона: для лечения и профилакти-

ки вирусных инфекций связано с использованием препаратов на основе генно-

инженерного рекомбинантного α2-ИФ. Его получают в культуре бактерий после встраивания в их геном гена человеческого α-ИФ. Рекомбинантный α2-

ИФ эффективен для лечения хронических гепатитов В и С, герпетической и па-

пилломавирусной инфекции.

23

3.Особенности противовирусного иммунитета.

1.Интерфероны (гликопротеины) продуцируются клетками при вирусной инфекции. Являются первой, наиболее ранней линией защиты (через несколько часов после начала размножения вируса).

2.Основной механизмом противовирусного иммунитета связан с клеточ-

ным иммунным ответом (ЦТЛ, NK-клетки и др.). При этом зараженные клетки погибают вместе с вирусом.

3. Противовирусные антитела (секреторные IgA и сывороточные IgM и G)

защищают только при внеклеточном расположении вирусов. Связываясь с ви-

рионами, они препятствуют их адсорбции на клетки.

4. Развитие вирусной инфекции всегда угнетает некоторые защитные ме-

ханизмы (подавление синтеза молекул MHC I класса зараженными клетками,

подавление активации комплемента по классическому и альтернативному пути

ит.д.).

4.Морфология и структура бактериофагов, их классификация.

Бактериофаги (от греч. bacterion – бактерии, phagos – пожирающий) –

вирусы бактерий, вызывающие их гибель.

Бактериофаги открыты в 1917 г. канадским ученым Ф. Д'Эррелем. Исследователь выделил из испражнений больных дизентерией фильтрующийся агент, способный разрушать, лизировать дизентерийные бактерии. Последующие наблюдения показали, что бактериофаги встречаются повсеместно, где есть бактерии: в почве, сточных водах, кишечном тракте человека и животных,

Ф. Д'Эррель гнойном отделяемом и др. В широком смысле слова их часто называют просто фагами.

В зависимости от формы и структурной организации фаги подразде-

ляют на пять морфологических групп (рис. 6):

I. Фаги I типа – нитевидной формы.

24

II. Фаги II типа – имеют головку и рудимент отростка.

III. Фаги III типа – имеют головку с коротким отростком.

IV. Фаги IV типа – имеют головку и длинный несокращающийся отросток.

V.Фаги V типа – имеют головку и длинный сокращающийся отросток.

Самое сложное строение у фагов V группы.

Рисунок 6 – Морфологическая классификация бактериофагов

Структура сложноустроенного фага (рис. 7):

-головка, в которой содержится нуклеиновая кислота;

-воротничковая часть;

-отросток, сверху покрытый сократительным чехлом. На конце отростка находятся базальная пластинка и нити прикрепления для адсорбции фага на бактериальной клетке.

Оболочечные структуры фага имеют белковую природу.

воротничковая часть

нити

прикрепления

Рисунок 7 – Структура сложноустроенного фага

25

5. Вирулентные и умеренные бактериофаги. Фазы взаимодействия ви-

рулентного бактериофага с клеткой. Практическое применение бакте-

риофагов.

В зависимости от характера взаимодействия с бактериальной клеткой, раз-

личают вирулентные и умеренные бактериофаги.

Вирулентные фаги способны вызывать взрывную продуктивную инфек-

цию. Проникнув в бактериальные клетки, они размножаются и вызывают лизис бактерий. Умеренные фаги чаще вызывают интегративную вирусную инфек-

цию, которая может переходить в продуктивную.

Фазы взаимодействия сложноустроенного вирулентного бактериофага

склеткой:

•Адсорбция (отростковой частью фага) на клеточной стенке бактерий. В эту фазу рецепторы базальной пластинки и нитей прикрепления специфически взаимодействуют с определенными рецепторами клеточной стенки бактерий.

На бактериях, лишенных клеточной стенки (L-формы, микоплазмы), фаги не адсорбируются.

•Проникновение нуклеиновой кислоты фага в клетку: происходит сокра-

щение чехла отростка и растворение с помощью фагового лизоцима неболь-

шого участка клеточной стенки бактерии. Затем ДНК из головки бакте-

риофага через канал отростка инъецируется (впрыскивается) в цитоплазму клетки, при этом оболочка фага остается на поверхности бактериальной клетки.

•Синтез фаговых частиц (подобно синтезу вирусов в эукариотической клет-

ке): происходит репликация нуклеиновой кислоты бактериофага с образова-

нием множества копий, а на рибосомах бактериальной клетки – синтез фаго-

вых белков головки и отростка.

•Композиция фаговых частиц: происходит сборка белковых оболочек и нуклеиновых кислот и формируются зрелые бактериофаги.

26

•Выход фагов из бактериальной клетки путем лизиса клетки изнутри. Он осуществляется за счет свободного лизоцима, выделяемого множеством фа-

гов, что приводит к гибели бактерий в результате ее осмотического лизиса.

Репродукция вирулентного фага в популяции бактерий, выращенных в жидкой питательной среде (МПБ), сопровождается их лизисом и просветлени-

ем среды (рис. 8а). В популяции чувствительных бактерий, выращенных сплошным газоном на плотной питательной среде (МПА), фаги образуют зоны очагового лизиса (рис. 8б), которые называются «негативными колониями» или стерильными бляшками.

Рисунок 8 – Результат взаимодействия вирулентного бактериофага с бак-

териальной популяцией на жидкой и плотной питательной среде

Умеренные фаги чаще взаимодействуют с клеткой по типу интегративной вирусной инфекции: ДНК фага интегрируется с ДНК клетки и называется про-

фагом. Став частью хромосомы бактерии, профаг, при ее размножении, пере-

дается бактериальному потомству. Клетка, несущая профаг, называется лизо-

генной. Под влиянием различных факторов (УФ-света, некоторых химических веществ) связь профага с ДНК бактериальной клетки нарушается и профаг пе-

реходит в цитоплазму клетки, где размножается и ведет себя как вирулентный.

27

Практическое применение бактериофагов

I. Для диагностики инфекционных заболеваний используют метод фа-

готипирования, когда с помощью известного набора фагов определяют фаго-

вариант исследуемых бактерий. Метод основан на высокой специфичности фа-

гов, т.е. способности взаимодействовать только с бактериями, имеющими спе-

цифические рецепторы для адсорбции фага и лизиса этих бактерий. Фаготипи-

рование используется для внутривидовой идентификации бактерий при диагно-

стике брюшного тифа, дизентерии, холеры, стафилококковых инфекций (рис.

9).

Рисунок 9 – Фаготипирование стафилококков с помощью набора различ-

ных типоспецифических фагов.

Метод фаготипирования имеет важное эпидемиологическое значение, т.к.

позволяет установить связи между источником инфекции и отдельными случа-

ями заболевания. Выделение бактерий одного фаговарианта от разных больных указывает на общий источник их заражения.

II. Для лечения.

Однокомпонентные препараты бактериофагов:

-стафилококковый бактериофаг (при гнойно-воспалительных заболева-

ниях, вызванных стафилококками);

-бактериофаг P. aeruginosa (при гнойно-воспалительных заболеваниях,

вызванных синегнойной палочкой);

28

- клебсиеллезный бактериофаг (при заболеваниях, вызванных клебсиел-

лами).

Комбинированные многокомпонентные препараты бактериофагов:

-коли-протейный бактериофаг (для лечения эшерихиозов и дисбактерио-

зов, вызванных бактериями рода Proteus);

-пиобактериофаг (для лечения стафилококковой, стрептококковой, клеб-

сиеллезной, протейной, синегнойной, энтерококковой инфекции и эше-

рихиозов);

-интести-бактериофаг (для лечения бактериальной дизентерии, сальмо-

неллезов, эшерихиозов, а также протейной, стафилококковой, энтеро-

кокковой и синегнойной инфекций).

Бактериофаги применяют местно путем аппликации на раневую или ожо-

говую поверхность, введением в полости (брюшную, плевральную, мочевой пу-

зырь), через рот, а также ректально. Соответственно способу применения пре-

параты бактериофагов выпускают в различных лекарственных формах (жидкая форма, таблетки, мази, свечи, аэрозоли). Перед назначением бактериофага

необходимо поставить пробу на чувствительность к нему выделенной

культуры микроорганизмов.

III. Для экстренной профилактики брюшного тифа и дизентерии у лю-

дей, контактировавших с больным, используют брюшнотифозный и полива-

лентный дизентерийный бактериофаги.

Практическая работа

1. Вирусологический метод диагностики (продолжение).

а) индикация и идентификация вируса гриппа в аллантоисной жидкости куриного эмбриона (схема).

II этап исследования: вскрытие куриных эмбрионов, взятие вируссодер-

жащей аллантоисной жидкости.

Скорлупу над воздушной камерой дезинфицируют, стерильными ножни-

цами срезают ее на 2-3 мм выше границы воздушной камеры. Через прокол в

29

хорионаллантоисной оболочке стерильной пипеткой набирают вируссодержа-

щую аллантоисную жидкость (3-4 мл) в стерильную пробирку. Индикацию ви-

руса гриппа в аллантоисной жидкости проводят в реакции гемагглютинации

(РГА) (табл. 4).

Таблица 4 – Индикация и определение титра вируса гриппа в РГА

Как видно из табл. 5, вначале наливают по 0,25 мл физ. раствора во 2, 3, 4, 5 и 6 лунки полистироловой пластины, а в 8-ю лунку – 0,5 мл. Затем готовят

30