Ðведение_в_виÑÑÑоÐогиÑ_2023

Фазы взаимодействия вируса с клеткой

I.Адсорбция вируса на клетке. В основе этого процесса лежит взаимодей-

ствие вирусных рецепторов со специфическими рецепторами клеток макро-

организма.

II. Проникновение вируса в клетку:

- через слияние суперкапсида вируса с мембраной клетки. В результате это-

го слияния в цитоплазму клетки попадает только нуклеокапсид, а суперкап-

сидная оболочка остается на поверхности клетки;

- путем эндоцитоза (пиноцитоза) с последующим освобождением вируса от суперкапсида в цитоплазме клетки.

III. Депротеинизация вируса – освобождение нуклеиновой кислоты от кап-

сидной оболочки.

IV. Синтез нуклеиновой кислоты и вирусных белков:

- для РНК-содержащих вирусов: на РНК вируса, как на матрице, с помо-

щью фермента «РНК-зависимая РНК-полимераза» происходит многократ-

ная репликация вирусной РНК для новых вирусных частиц. Так как вирус-

ная РНК аналогична клеточной м-РНК, она транслируется (перемещается)

на рибосомы хозяина, в результате чего синтезируются структурные белки оболочек вируса (рис. 2);

Рисунок 2 – Процесс внутриклеточного синтеза РНК-содержащих вирусов

Среди РНК-содержащих вирусов различают:

•плюс-нить РНК (+РНК) выполняет как функцию генома вируса, так и функцию информационной РНК (иРНК), так как она способна распознавать

рибосомы клеток макроорганизма;

11

•минус-нить РНК (-РНК) выполняет только функцию вирусного генома и не может быть иРНК. В инфицированной клетки -РНК служит матрицей для синтеза иРНК. Этот синтез происходит только под действием вирусного белка-фермента транскприптазы, который обязательно имеют минус-

нитевые вирусы.

- для ДНК-содержащих вирусов: на ДНК вируса, как на матрице, с помо-

щью фермента «ДНК-зависимая ДНК-полимераза» происходит многократ-

ная репликация вирусной ДНК для новых вирусных частиц. Кроме того, на ДНК вируса под действием фермента «ДНК-зависимая РНК-полимераза» запускается синтез м-РНК, которая транслируется на рибосомы клетки-

хозяина для синтеза структурных белков оболочек вируса (рис. 3).

Рисунок 3 – Процесс внутриклеточного синтеза ДНК-содержащих вирусов

V. Композиция вирусных частиц (сборка). Формирование зрелых вирусов.

VI. Выход из клетки вирусного потомства.

5.Интегративный тип вирусной инфекции.

Взависимости от типа вирусной нуклеиновой кислоты различают два варианта интегративной инфекции:

для ДНК-содержащих вирусов: происходит интеграция ДНК вируса с ДНК

клетки-хозяина;

для РНК-содержащих вирусов: на вирусной РНК под действием фермента

«РНК-зависимая ДНК-полимераза» (обратная транскриптаза или ревертаза)

12

синтезируется ДНК. Затем образовавшаяся вирусная ДНК интегрируется с ДНК клетки-хозяина.

В результате интегративной инфекции возможно превращение (трансфор-

мация) нормальных клеток в опухолевые. Интегративная инфекция характерна для онкогенных (опухолевых) вирусов и умеренных бактериофагов.

6.Вирусный онкогенез. Механизмы. Основные онкогенные вирусы, вызы-

вающие опухоли у человека.

В 50-х годах XX столетия Л.А. Зильбер сформули-

ровал вирусогенетическую теорию, согласно кото-

рой вирусная ДНК интегрирует с ДНК клетки-

хозяина, что приводит к трансформации нормаль-

ных клеток в опухолевые.

Л.А. Зильбер (советский иммунолог и вирусолог)

В геноме нормальных клеток существуют клеточные онкогены (протоон-

когены). Они находятся в неактивном состоянии и кодируют белки, стимули-

рующие размножение клеток во время эмбрионального развития, а также рост и размножение клеток во взрослом состоянии, когда в этом есть необходимость.

Онкогенез для ДНК-содержащих вирусов

Некоторые ДНК-содержащие вирусы имеют онкогены, сходные с челове-

ческими. Функции вирусных онкогенов разнообразны и при интеграции ДНК вируса в геном клетки человека они могут нарушать синтез нормальных факто-

ров размножения клетки на разных этапах. Итогом таких взаимодействий явля-

ется избыточное размножение клетки и деление ее в незрелом состоянии.

Так формируется опухоль.

13

Онкогенез для РНК-содержащих вирусов

РНК-содержащие вирусы, способны индуцировать онкогенез, выступая в роли канцерогенных факторов. На вирусной РНК с помощью собственного фермента «РНК-зависимая ДНК-полимераза» (обратная транскриптаза) синте-

зируются ДНК. Затем вирус встраивает в геном клетки свою ДНК-копию

рядом с клеточным онкогеном и вызывает повышение его активности. Это

приводит к злокачественной трансформации клетки.

Основные онкогенные вирусы, вызывающие опухоли у человека представ-

лены в табл. 2.

Таблица 2 – Основные онкогенные вирусы, вызывающие опухоли у человека

7. Вироиды и инфекционные прионы.

Кроме типичных вирусов, существуют необычные инфекционные агенты:

вироиды и прионы.

Вироиды – в отличие от вирусов, состоят только из молекулы одноцепо-

чечной кольцевой РНК, обладающей инфекционными свойствами. Известно более 10 различных вироидов, вызывающих инфекционные заболевания у рас-

тений.

14

Инфекционные (патологические) прионы (от англ. рrotein infections particle – белковая инфекционная частица) – белковые инфекционные агенты, при-

водящие к развитию летальных неврологических заболеваний – губчатых энце-

фалопатий.

У человека и млекопитающих в клетках ЦНС имеются нормальные прио-

новые белки, выполняющие ряд регулирующих функций. Патогенез поражений обусловлен способностью инфекционного прионового белка при попадании в нейрон образовывать агрегаты с нормальным прионовым белком. В результате клеточный прион меняет пространственную конфигурацию молекулы: α-

спираль нормального белка заменяется другой изоформой – β-конформацией.

Такой белок не способен выполнять свои функции. Он накапливается в клетках мозга, формируя крупные конгломераты инфекционных прионов, что приводит к губкообразному перерождению серого и белого вещества головного мозга и развитию медленной летальной инфекции.

Прионы высоко резистентны ко многим факторам их инактивации. Явля-

ясь нормальными белками человека, они не вызывают защитных реакций (вос-

паление, выработка антител и др.).

8. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

Молекулярно-биологический: обнаружение специфических участков ви-

русной нуклеиновой кислоты с помощью ПЦР (см. учебно-методическое посо-

бие «Основные формы бактерий. Строение бактериальной клетки», стр. 14-15).

15

Определение вирусных антигенов (экспресс-диагностика): вирусные антигены определяют в крови и других биологических жидкостях с помощью серологических реакций, чаще это РИФ и ИФА (см. учебно-методическое по-

собие «Учение об инфекции и иммунитете. Основы иммунологии», стр. 36-39).

Вирусологический: заражение исследуемым материалом биологической модели (куриный эмбрион, культура клеток, организм животного) с последую-

щей индикацией, а затем идентификацией обнаруженных вирусов.

Для размножения вирусов в курином эмбрионе исследуемый материал вводят в аллантоисную или амниотическую полость (культивируют вирусы гриппа, эпидемического паротита и др.).

Для размножения вирусов в культуре клеток исследуемым материалом заражают живые клетки различного происхождения: эмбриональные, нормаль-

ных тканей, опухолевые (культивируют вирусы полиомиелита, парагриппа,

аденовирусы и др.).

Для размножения вирусов в организме лабораторных животных исполь-

зуют белых мышей (культивируют вирусы бешенства, клещевого энцефалита).

Помимо диагностики вирусных инфекций, культивирование вирусов про-

водят с целью получения вакцинных и диагностических препаратов.

Серологический: определение противовирусных антител в сыворотке крови больного. Особенностью серологического метода диагностики вирусных инфекций является исследование парных проб сыворотки. Первую пробу сы-

воротки берут у больного в начале заболевания, а вторую – через 10-14 дней. О

наличии вирусной инфекции свидетельствует сероконверсия, т.е. нарастание титра антител во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностически значимой является сероконверсия для взрослых в 4 раза, а для детей – в 2 раза.

Вирусоскопический: обнаружение в исследуемом материале включений,

образующихся в пораженных клетках при вирусной инфекции. Включения представляют собой скопления вирусов и продуктов реакции клетки на вирус-

ную инфекцию. Включения могут располагаться в цитоплазме или в ядре клет-

ки-хозяина. Чаще внутрицитоплазматические включения образуют РНК-

16

содержащие вирусы (например, включения Бабеша-Негри при бешенстве).

Внутриядерная локализация включений в большей степени характерна

для ДНК-содержащих вирусов (например, включения при цитомегаловирус-

ной инфекции). В мазках видны гигантские клетки с внутриядерными включе-

ниями вирусов. Такие клетки напоминают «совиный глаз» (рис. 4).

Рисунок 4 – Вирусоскопическое исследование среза слюнных желез при ЦМВИ

Практическая работа

1. Изучение под микроскопом готовых препаратов включений Бабеша-

Негри (окраска по Селлерсу). Краситель Селлерса состоит из 2-х частей 1%

раствора метиленовой сини в метиловом спирте и 1 части 1% раствора основ-

ного фуксина в метиловом спирте. Его наносят на 1-5 секунд на влажный, не-

фиксированный мазок-отпечаток из ткани мозга, чаще из области гиппокампа

(аммонова рога) человека или животного, погибшего от бешенства. При свето-

вой микроскопии с иммерсионной системой на голубом фоне цитоплазмы нейронов видны розово-красные включения Бабеша-Негри (четко контуриро-

ваны, имеют овальную или продолговатую форму и зернистую структуру). 2. Вирусологический метод диагностики.

а) культивирование вирусов в курином эмбрионе (схема).

I этап исследования: заражение куриных эмбрионов в аллантоисную по-

лость материалом от больного с подозрением на гриппозную инфекцию.

С помощью овоскопа определяют расположение и границы воздушной ка-

меры (отметить карандашом). Скорлупу яйца в области воздушной камеры об-

рабатывают раствором йода. Пробойником делают отверстие в центре камеры,

17

затем шприцем вводят вируссодержащую жидкость в количестве 0,1-0,2 мл в аллантоисную полость. Отверстие парафинируют. Зараженные эмбрионы по-

мещают в термостат при 370С на 48 часов.

б) культивирование вирусов в культуре клеток Нер-2 (схема).

I этап исследования: приготовление перевиваемой культуры клеток Нер-2.

Для получения монослоя культуры клеток (КК) количество клеток во взве-

си подсчитывают в камере Горяева. Взвесь клеток разводят средой 199 до ко-

личества 100000 клеток в 1 мл. В стерильный пенициллиновый флакон сте-

рильной пипеткой над пламенем спиртовки вносят 1 мл взвеси клеток в пита-

тельной среде 199, закрывают флакон стерильной резиновой пробкой. На фла-

коне маркером проводят продольную черту. Затем помещают флакон в специ-

альный штатив в горизонтальном положении, чертой кверху, и ставят в термо-

стат при 370С на 3-5 дней для получения монослоя клеток на стенке флакона.

IIэтап исследования:

▪микроскопический контроль выросшей культуры клеток Нер-2. Под малым увеличением микроскопа просматривают КК. Для заражения отбирают фла-

коны с полноценным монослоем (видны прозрачные, блестящие клетки,

имеющие отростки, прикрепленные к стеклу);

▪заражение КК отделяемым из носоглотки больного с подозрением на адено-

вирусную инфекцию. Во флакон с полноценным монослоем клеток над пла-

менем спиртовки вносят стерильной пипеткой вируссодержащую жидкость в объеме 0,1 мл. Затем второй стерильной пипеткой добавляют во флакон 0,9

мл среды 199 с бычьей сывороткой. Флаконы с зараженной культурой клеток укладывают в штатив и ставят в термостат при 370С на 48-72 часа.

18

Занятие №2

Тема. Вирусологический метод диагностики. Интерфероны, классификация,

механизм действия, практическое применение. Особенности противовирусного иммунитета. Бактериофаги.

Цель занятия. Освоить принципы индикации и идентификации вирусов.

Изучить особенности противовирусного иммунитета. Изучить свойства бакте-

риофагов, их практическое применение.

I.Теоретические знания:

1.Вирусологический метод диагностики. Методы индикации и идентификации вирусов.

2.Интерфероны, классификация. Механизм действия. Практическое примене-

ние.

3.Особенности противовирусного иммунитета.

4.Морфология и структура бактериофагов, их классификация.

5.Вирулентные и умеренные бактериофаги. Фазы взаимодействия вирулентно-

го бактериофага с клеткой. Практическое применение бактериофагов.

II.Практические навыки:

1.Изучить методику вскрытия куриного эмбриона и взятия вируссодержащей аллантоисной жидкости.

2.Учет реакции гемагглютинации и торможения гемагглютинации для индика-

ции и идентификации вируса гриппа по демонстрации.

3.Учет цитопатогенного действия аденовирусов на культуру клеток по демон-

страции.

4.Учет реакции нейтрализации в культуре клеток для идентификации аденови-

русов по демонстрации.

5.Изучить методику определения фаготипа бактерий.

19

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

1.Вирусологический метод диагностики. Методы индикации и идентифи-

кации вирусов.

Методы индикации вирусов

Индикацию (обнаружение) вирусов в материале от больного проводят

различными способами. Они зависят от метода культивирования вируса:

• Если вирус размножается в курином эмбрионе, то для его обнаружения используют реакцию гемагглютинации (РГА). Она основана на способности вирусов склеивать (агглютинировать) эритроциты с помощью фермента ге-

магглютинина, расположенного в суперкапсиде вируса. В результате реакции in vitro наблюдается осадок эритроцитов в виде «перевернутого зонтика» – это положительный результат РГА. При отрицательной реакции – выпадает осадок эритроцитов с ровными краями. Используют для индикации вирусов гриппа.

•Индикацию вирусов, культивируемых в культуре клеток проводят по их

цитопатогенному действию (ЦПД) на клетки (рис. 5). ЦПД выражается в по-

вреждении монослоя зараженной культуры клеток и изменении их морфологии:

клетки округляются, темнеют, теряют отростки, в них появляется зернистость.

Эти изменения обозначают термином «дегенерация клеток». В дальнейшем происходит отслойка клеток от стекла – нарушение монослоя. Используют для индикации вирусов полиомиелита, аденовирусов.

а) б)

Рисунок 5 – Культура клеток: нормальная (а), дегенерированная (б)

20