Пол в норме и при патологии. Пол при патологии и гипоксии. Фагоцитоз

Биологическое значение ПОЛ, свободно-радикальных

процессов и АФК

Свободно-радикальные процессы (СРП), в частности ПОЛ, являются одним из типов естественных метаболических процессов, необходимых для существования организма. Имеется определённый стационарный уровень ПОЛ, причём в активно метаболизирующих тканях этот уровень выше.

Таблица. Физиологическое значение отдельных АФК

радикал	Функция
NO˙	регулирует тонус сосудов; ингибирует адгезию гранулоцитов; ингибирует агрегацию тромбоцитов.
гипогалоиды (OCl-) H2O2 супероксидный анион-радикал	микробицидное действие (антимикробная защита грудного молока, фагоцитоз); индукция клеточной пролиферации (лимфоциты); метаболизм Fe++
HO2˙, HO˙, OH-, OCl-	включают программу апоптоза заражённой клетки

Предполагается, что роль СРП при патологических состояниях и экстремальных воздействиях на организм представляет собой продолжение их аналогичной роли в физиологических условиях. Сформулировано положение о том, что активация процесса ПОЛ является «первичным медиатором стресса», то есть посредником между внешним воздействием и активацией стресс-реализующих систем организма. Однако при продолжении и усилении стрессового воздействия роль СРП меняется: происходит вторичная, не регулируемая активация ПОЛ, развивается окислительный стресс и формируется «свободно-радикальная патология». Следует отметить, что термин «свободно-радикальная патология» биохимический и оспаривается физиологами, но для удобства определения значения ПОЛ допустимо его использование в контексте.

Схема. Взаимосвязь СРП с метаболическими процессами.

С тресс

С Р ПОЛ (первичный медиатор стресса)

н ейроэндокринный аппарат регуляции

Щ .Ж. надпочечники

стресс-реализующие системы

КАТАБОЛИЗМ

П ОВРЕЖДЕНИЕ ЗАЩИТА

α-токоферол

В ЭГ Прооксиданты Антиоксиданты мочевина

С а²⁺ мочевая к-та

Липоперекиси фермент. нефермент.

F e²⁺ (внутриклет.) (внеклеточ.)

Буферный катаболизм

Р аспад неустойчивых клеток

На схеме: СР – свободные радикалы; ВЭГ – внеэритроцитарный гемоглобин; ЩЖ – щитовидная железа.

К настоящему времени установлено, что СРП и другие процессы тканевого и клеточного метаболизма взаимосвязаны. С одной стороны, свободно-радикальные процессы усиливают повреждение и стимулируют катаболизм, с другой – многие продукты катаболизма способны модифицировать интенсивность СРП. Так, продукты липолиза и фосфолиполиза, внеэритроцитарный гемоглобин (ВЭГ) и железосодержащие метаболиты обладают прооксидантным действием. В тоже время, при усилении образования прооксидантнов возрастает физиологическая роль антиоксидантнов.

Известно, что уровень СРП находится под контролем систем антиоксидантной защиты, находящихся между собой в сложном взаимодействии. Существуют ферментативные и не ферментативные системы антиоксидантной защиты. Роль последних при повреждении особо велика, так как есть основания полагать, что при данного рода воздействии СРП инициируются не внутри клетки, где преобладают ферментативные антиоксиданты, а снаружи, где активность эндогенных ферментов антиоксидантной системы незначительна. Зато во внеклеточном пространстве широко представлены не ферментативные антиоксиданты, как высоко-, так и низкомолекулярные, и многие из них способны легко проникать через мембраны внутрь клеток. Среди низкомолекулярных антиоксидантов особая роль принадлежит витамину Е, продуктам азотистого обмена – мочевине и мочевой кислоте.

Предложена концепция (концепция буферного катаболизма), суть которой состоит в том, что генетически запрограммированная смерть неустойчивых к действию гипероксии (повышенного давлению кислорода) клеточных линий в тканях и системе крови способствует накоплению низкомолекулярных катаболитов-антиоксидантов. Они защищают клетки и ткани от окислительного стресса и представляют собой один из возможных механизмов адаптации.

ПОЛ при гипоксии.

Как ведущий патогенетический фактор многих заболеваний человека, гипоксия объединяет комплекс процессов в организме, обусловленных кислородной недостаточностью.

Кислородная недостаточность является следствием неадекватного снабжения тканей кислородом или нарушение утилизации в них кислорода. Ранее полагалось, что снижение рО₂ в клетках автоматически влечёт за собой снижение интенсивности СРП, в частности ПОЛ. Сейчас установлено, что при тотальной ишемии, то есть при полном прекращении кровоснабжения ткани длительно сохраняется остаточный кислород, что создаёт условия для протекания ПОЛ.

«Кислородный парадокс» или реоксигенационный синдром.

Типичная смена физиологического эффекта СРП на патологический наблюдается в условиях гипо- и гипероксии. Было обращено внимание на тот факт, что реоксигенация, то есть подача кислорода после гипоксии или ишемии нередко не нормализует состояние организма, а напротив, усугубляет начавшиеся патологические процессы. Это явление получило название кислородный парадокс. При реоксигенации ишемизированной ткани процессы ПОЛ в ней резко усиливаются, а сама ткань подвергается сильной деструкции.

Активные формы кислорода

Активацию ПОЛ и деструкцию тканей при ишемии с последующей реокигенацией также связывают с образованием свободных радикалов. Ведущую роль в этом играет супероксидный анион-радикал, а затем гидрокисльный радикал, синглетный кислород, гидроперекиси органической и неорганической природы. Эти данные подверждаются экспериментами, показавшими, что добавление СОД в среду тормозит накопление продуктов ПОЛ в ткани и улучшает её физиологические параметры. Ещё более заметный эффект наблюдается при комбинированном введении СОД и каталазы. Избыток свободных радикалов при гипоксии и патологических состояниях направлен на три главные «клеточные цели»:

1. мембраны, так как полиненасыщенные жирные кислоты, содержащиеся в фосфолипидах, как пери-, так и интрацеллюлярно особенно чувствительны к свободным радикалам. На уровне двойных связей возникает аутокаталитическая реакция, которая распространяется и действует на архитектонику мембран вплоть до полного лизиса.

2. нуклеиновые кислоты – свободные радикалы вызывают «переломы» хромосом с последующим нарушением мультипликации, трансмиссии и репликации генетической информации.

3. белки, главным образом – содержащие сульфгидрильные группы (например, Са-АТФ-аза – критический белок). Свободные радикалы способствуют образование сшивок в белках, деградации белков и аминокислот (Fe и Cu – содержащие белки (церулоплазмин), альбумины, липопротеиды и т.д.)

При гипоксии усиление фосфолиполиза вызывает активацию каскада арахидоновой кислоты: усиление цепи метаболических превращений арахидоновой кислоты, обусловленных повышением активности ферментов циклооксигеназы и липоксигеназы. Конечными продуктами этого метаболического пути являются простагландины, тромбоксан и лейкотриены, а побочными супероксидный анион-радикал и гидроксильный радикал.

Источники АФК при гипоксии.

Согласно существующим гипотезам, основными источниками АФК при гипоксии и реперфузии (ишемии) являются:

1. переход ксантиндедрогеназы в ксантиноксидазную форму;

2. нарушение работы дыхательной цепи в митохондриях и активация микросомального окисления;

3. нарушение кальциевого гомеостаза, активация фосфолипаз, усиление каскада арахидоновой кислоты по липоксигеназному и циклооксигеназному пути;

4. накопление ионов Fe²⁺ (мощного прооксиданта) из ферритина и внутриклеточных компартментов»

5. окисление гемоглобина в метгемоглобин, накопление внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ);

6. аутоокисление катехоламинов, повышенное при стрессе;

7. активация нейтрофилов, в которых происходит «дыхательный взрыв»;

8. накопление NO˙.

Роль ксантиноксидазы (КО).

Важная роль ксантиноксидазной системы в генерации радикалов была установлена в работах МакКорда в 1985 г. Фермент состоит из двух субъединиц, в составе имеет два атом Fe и четыре атома Мо. Было обнаружено повышение активности фермента в кишечнике при гипоксии и сделано предположение о том, что это происходит за счёт протеолитической модификации ксантиндегидрогеназы, которая в нативной форме не способна восстанавливать молекулярный кислород и, следовательно, продуцировать супероксидный анион-радикал. Но, после ограниченного протеолиза фермент приобретает оксидазную активность. Эксперименты с применением ингибитора КО - аллопуринола, также подтвердили участие КО в реперфузионном повреждении тканий. Отмечается, что количество КО довольно сильно варьирует в различных органах и в одном органе у разных видов животных. Так, сердце крысы содержит значительные количества КО, тогда как в сердце человека она практически отсутствует. Активация наработки супероксида может быть связана с увеличением концентрации субстрата КО – гипоксантина при гипоксии.

МакКорд предположил, что механизм усиленного образования АФК при ишемии в тканях связан с повышением распада адениннуклеотидов и образованием ксантина. В митохондриях, выделенных из ишемизированного миокарда, усиливается одноэлектронное восстановление кислорода с образованием супероксидного анион-радикала. В связи с этим увеличивается степень восстановленности переносчиков дыхательной цепи.

Итак, в отсутствие кислорода происходит нарушение работы дыхательной цепи, что способствует неполному восстановлению кислорода. На участке между сукцинатдегидрогеназой и цитохромом b первоначально образуется супероксидный анион-радикал, а затем пероксид водорода.

Кальциевый парадокс

Активация фосфолипаз является ещё одним возможным механизмом инициирования ПОЛ при ишемии. Активация фосфолипаз, в свою очередь, связана с явление так называемого «кальциевого парадокса». Кальциевый парадокс тесно связан с килородным парадоксом и является одним из наиболее существенных признаков реперфузионного повреждения ткани. Вследствие повышения концентрации ионов Са²⁺ в плазме крови при реперфузии усиливается его поступление в клетку через плазматическую мембрану, а затем в митохондрии. Накопление Са²⁺ в матриксе митохондрий – основная причина разобщения окислительного фосфорилирования, снижения синтеза макроэргов, то есть причина утраты митохондриями своей основной функции.

Вызываемая гиперкальциемией активация липолиза и фосфолиполиза также приводит к ряду неблагоприятных последствий:

1. усиление ПОЛ;

2. повышение проницаемости мембран сначала для одно- и двухвалентных ионов, а затем и высокомолекулярных соединений (это касается цитоплазматической мембраны и мембран всех субклеточных структур – митохондрий, лизосом, пероксисом и т.д.);

3. повреждение мембран лизосом приводит к выходу в цитоплазму липаз и протеаз, а мембран пероксисом – к активации ферментов, генерирующих пероксид водорода;

4. аутолиз клетки и гиперферментемия.

Гипервитаминоз

Повышение содержания витаминов А и Д приводит к лизису мембран эритроцитов. Эти витамины способны встраиваться в мебраны, увеличивая их эластичность за счёт нарушения гидрофобных и гидростатических взаимодействий между белковыми и липидными компонентами мембран. В результате ацильные остатки ненасыщенных жирных кислот становятся доступными свободно-радикальному окислению.

Причины нарушения равновесия в системе прооксиданты-антиоксиданты.

Интенсификация наработки АФК наблюдается при воспалительных и аутоиммунных процессах, токсикозах, генетической патологии, загрязнении воздушной среды прооксидантами (озон, окислы азта, альдегиды, угарный газ). Ярким примером воздействия внешних сил является проинкающая радиация, способствующая отрыву электронов от молекул воды, УФ-излучение, ультразвук, высокочастотные магнитные поля, а в клинике – бронхит курильщика.

Старение организма сопровождается изменением процессов ПОЛ в сторону увеличение перекисей в клетке. В пользу этого говорят следующие факты: накопление липофусцина – пигмента старости, являющегося комплексом окисленных жирных кислот фосфолипидов и белков. Вследствие нарушения целостности и функционирования мембран происходит нарушение метаболизма, обеспечивающего деление клетки.

Опухолевый процесс. Предположение об участии свободных радикалов в пусковом механизме перерождения клеток здоровых тканей в опухолевые было высказано сразу несколькими учёными (Йенсен, Горли, Хердлоу). Предполагается, что в результате взаимодействия канцерогенного фактора с клеткой выделяется энергия, которая инициирует образование свободных радикалов.

Воспаление. В условиях ишемии в результате действия супероксидного анион-радикала выделяются хемотаксические вещества, вызывающие усиление притока нейтрофилов к ткани. Чем больше лейкоцитов, тем больше зона поражения. Продукты ПОЛ усиливают образование хемоаттрактантов лейкоцитов, что приводит к дальнейшему усилению их миграции, активации и развитию воспалительной реакции в зоне гипоксического поражения ткани.

Молекулярные механизмы фагоцитоза

Фагоцитозов («фаго» - пожираю, «цитос» - клетка) называется процесс поглощения и переваривания микробов и животных клеток клетками фагоцитами. Учение о фагоцитозе создал великий русский учёный И.И. Мечников, которого следует считать основоположником учения не только о фагоцитозе, но и об иммунитете. В фагоцитозе он видел основу воспалительной реакции, выражающей защитные свойства организма. В тех случаях, когда микроорганизмы легко поглощаются и подвергаются затем разрушению лейкоцитами, организм легко справляется с инфекцией. Это способствует невосприимчивости организма к инфекции и формированию иммунитета. Помимо лейкоцитов, циркулирующих в крови (нейтрофилы, гранулоциты, моноциты), фагоцитарной активностью обладают фиксированные клетки селезёнки, купферовские клетки печени – тканевые макрофаги, альвеолярные макрофаги.

Фагоцитоз протекает в три стадии:

1. узнавание и адгезия, в ходе которой фагоцитарные клетки вступают в контакт с чужеродной клеткой;

2. захват и поглощение, при которой чужеродная клетка попадает в цитоплазму фагоцита;

3. внутриклеточная деструкция захваченной клетки.

Совершенно уникальным положительным для организма феноменом, в основе которого лежит активация СРП, являются сопутствующие фагоцитозу продукция и выделение фагоцитами АФК и их производных, имеющее защитное значение. Выраженное повышение уровня метаболизма фагоцита, возникающее в ответ на стимулирующее действие, получило название «респираторный или дыхательный взрыв». При этом наблюдается увеличение интенсивности дыхания фагоцита в 10-20 раз, однако этот процесс направлен на активацию аэробных путей обмена субстратов, а на активацию реакций образования соединений пероксидной природы, с помощью которых нейтрофилы уничтожают фагоцитированные микроорганизмы. Всё вышесказанное можно представить как «комплекс четырёх повышений»:

1. повышение потребления кислорода;

2. повышение потребления глюкозы и её окисления по пентозофосфатному пути;

3. повышение продукции супероксидного анион-радикала;

4. повышение продукции пероксида водорода.

Кислородзависимые механизмы фагоцитоза

Считается что начальным этапом в образовании биоцидных кислородных радикалов и метаболитов является восстановление молекулярного кислорода НАДФН-оксидазой с образованием супероксидного анион-радикала который становится родоначальником других биоцидных соединений.

НАДФН₂ + 2О₂ 2О₂^• + НАДФ⁺ + 2Н⁺

Образовавшийся радикал кислорода не обладает бактерицидным свойством. Оно характерно для Н₂О₂ образующегося при дисмутации кислородного радикала или спонтанно или каталируемой СОД:

О ₂^• + О₂^• Н₂О₂ + ¹О₂

Пероксид водорода может оказывать бактерицидное действие особенно в присутствии аскорбиновой кислоты и Fe²⁺ , но это действие несравнимо с эффектом в присутствии миелопероксидазы (МПО).

МПО (Н₂О₂-оксидоредуктаза) – фермент с молекулярной массой 120-160 кДа, состоящий из двух тяжёлых гем-содержащих α-цепей (55-63 кДа) и двух лёгких β-цепей (10-15 кДа). α-субъединицы соединены единичной дисульфидной связью и содержат две ковалентно связанные гемм-содержащие простетические группы. У человека ген, кодириующий МПО расположен в длинной плече 17-ой хромосомы. Синтез фермента происходит на стадии промиелоцита, после чего миелопероксидаза локализуется в азурофильных гранулах нейтрофильных гранулоцитов и составляет 5% сухой массы клетки. Миелопероксидаза имеет интенсивный зелёный цвет, что обуславливает характерный для гноевых масс зеленоватый оттенок. Фермент содержится также в моноцитах, но никогда не встречается в гранулах эозинофилов, содержащих другой фермент.

Дегрануляция, которой сопровождается активация нейтрофилов приводит к высвобождению МПО и инициации образования гипогалоидов, являющихся важным компонентом микробицидного потенциала полиморфноядерных лейкоцитов. На образование первичного продукта реакции - HOCl (гипохлорной кислоты), которая находится в равновесии с OCl^-, расходуется 28% потребляемого активированными нейтрофилами кислорода или 40% образующегося пероксида водорода. При этом концентрация HOCl в очаге воспаления может достигать 100 мкМ. Так как миелопероксидаза обладает хорошей растворимостью в липидной фазе мембран, то при высвобождении в процессе дегрануляции она преимущественно концентрируется на границе раздела фаз и участвует в создании микробицидного потенциала слизистых поверхностей на теле человека и, по-видимому, даже хрусталика глаза. Итак, фермент катализирует реакцию между галогенами и пероксидом водорода:

C l^- + H₂O₂ OCl^- + H₂O

МПО

Механизм действия миелопероксидаза объясняется двумя способами.

Под действием гипохлорида происходит хлорирование структур микробной мембраны, которые при этом нарушаются, а микробы гибнут.

Другой механизм основан наблюдением, что миелопероксидаза может действовать как декарбоксилаза аминокислот согласно уравнению:

O Cl^- + H⁺ + H₂N–CH–COOH RCHO + CO₂ + NH₄⁺ + Cl^-

│ МПО

R

На микробы губительное влияние оказывает как разрушение аминокислот их мембран, так и возникновение альдегидов, которые могут быть для них токсичны.

Хемилюминесценция, сопровождающая фагоцитоз, объясняется возникновением или суперокидного анион-радикала, или гидроксильным радикалом. Эта форма кислорода тоже высоко реактивна и уничтожает бактерии, если в их структуре присутствует молекула каротиноидов, которые связывают супероксидный радикал кислорода.

В качестве доступного способа изучения свободно-радикальных процессов в биологических системах широкое распространение получила регистрация хемилюминесценции – сверхслабого свечения, возникающего практически при любых процессах свободно-радикального окисления и обусловленного выделением в виде квантов излучения свободной энергии частицами при переходе из возбуждённого состояния в основное, характеризующееся меньшим энергетическим потенциалом. Регистрируя излучение той или иной длины волны можно судить о том, какой именно свободно-радикальный процесс идёт в системе. Более полное представление о характере протекающих в системе химических реакций может дать регистрация хемилюминесценции, опосредованной различными соединениями-зондами. Так, например, известно, что хемилюминесценция, опосредованная люминолом, обусловлена взаимодействием данного вещества с гидроксильным и супероксидным анион-радикалом. В случае регистрации свечения нейтрофилов свечение обусловлено ещё и реакцией с гипохлорид-ионом. Хотя суммарное, опосредованное люминолом свечение, является следствием нескольких реакций, разграничение во времени гипогалогенитного и кислородно-радикального компонента при регистрации стимулированной хемилюминесценции позволяет дифференцированно судить о каждом из них.

Учитывая то, что ведущая роль в реализации защитных свойств полиморфноядерных лейкоцитов принадлежит продукции гипогалогенитных ионов, регистрируя люминол-опосредованную хемилюминесценцию цельной крови, можно получить сведения о состоянии именно этого фактора микробицидности. О скорости продукции гипогалогенитных ионов под воздействием миелопероксидазы можно судить по углу наклона участка кривой свечения, соответствующего первым секундам после стимуляции фагогцита. Дальнейший подъём кривой обусловлен суммой всех реакций активных соединений с люминолом и, в большей степени, характеризует процесс выработки свободных радикалов. На схеме представлен стандартный хемилюминесцентный ответ полиморфноядерного лейкоцита на стимуляцию опсонизированным зимозаном.

Стандартная кривая хемилюминесцентного ответа полиморфноядерного лейкоцита на стимулятор – опсонизированный зимозан ( по А.Н. Маянскому, Д.Н. Маянскому, 1989).

Первой минуте регистрации соответствует спонтанная хемилюминесценция, величина которой (условно принимаемая за единицу), характеризует базальную продукцию кислородных метаболитов фагоцитом. В ответ на стимул наблюдается быстрый, буквально в течение нескольких секунд, подъём кривой, который к пятой-пятнадцатой минуте сменяется спадом, который обычно регистрируют до достижения половинного уровня от максимума. По скорости этого спада можно судить о гипо- или гиперреактивном состоянии фагоцита, что в осчетании с данными о соотношении величин базальной и стимулированной хемилюминесценции даёт достаточно полную характеристику биоцидного метаболизма.

Гипохлоритный ион эффективно проникает в поверхностный фосфолипидный слой циркулирующих в крови липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и вызывает их окисление, они становятся токсичными индуцируя тем самым захват ЛПНП макрофагами через «скэвенджер-рецепторы». Цитотоксическое действие нейтрофилов в очаге воспаления отчасти опосредовано гипогалоид-индуцированной мобилизацией иона цинка из металлопротеидов. Однако, способность гипогалоидов прямо разрушать клетки-мишени незначительна и их деструктивное действие опосредовано нарушением транспортных функций мембранных белков, инактивацией АТФ-синтетазы, усилением активности протеиназ через инактивацию их ингибиторов, активацией белков системы комплемента. Кроме того, гипогалоиды и пероксид водорода оказывают селективный ингибирующий эффект на клеточное деление, синтез ДНК и РНК и продукцию белков клеточного деления кишечной палочки. При этом, HOCl обладает более выраженным эффектом, чем пероксид водорода.

На клеточном уровне продукты системы МПО (хлорированные белки) участвуют в развитии воспалительного процесса, усиливая адгезию гранулоцитов к эндотелию и их трансэндотелиальную миграцию либо прямо, либо опосредовано через активацию медиаторов воспаления, таких как лейкотриен В₄.

Мишенями МПО-опосредованной системы нейтрофилов является чрезвачайно широкий спектр клеток и молекул. В определённых условиях МПО выступет как антиоксидант, являясь второй линией защиты от токсических производных NO-радикалов. МПО взаимодействует с пероксинитритом с образованием нитритов и нитратов:

МЕП + HONOO → МПО–I–NO₂^- →МЕП–II–NO₂˙

NO₂˙ → N₂O₄

N₂O₄ + H₂O → NO₃^- + NO₂^- + H⁺

При этом реакция резко ускоряется при снижении рН, что особенно важно для воспалительного очага, характеризующегося кислой средой.

Кроме реакций, прямо связанных с образованием бактерицидных соединений (пероксид водорода, гипохлорида и супероксидного анион-радикала), с повышенной активностью должны проходить и реакции, поставляющие полупродукты, наличие которых в достаточном количестве необходимо для синтеза бактерицидных соединений.

Так, в реакции, катализируемой НАДФН-оксидазой, возникает НАДФ⁺, избыток которого ускоряет течение реакций пентозофосфатного цикла, особенно дегидрирование глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата.

В цитоплазме нейтрофила возникает избыток пероксида водорода, который необходимо устранить. Один из механизмов представлен глутатионпероксидазной реакцией:

H ₂O₂ + 2G—SH _ГПО H₂O + G—S—S—G

Восстановленная форма глутатиона (GSH) образуется в результате реакции, катализируемой глутатионредуктазой:

2 G—S—S—G + 2НАДФН_{2 ГР} 4G—SH +2 НАДФ⁺

Избыток пероксида водорода может быть устранён и в результате действия каталазы, но эта реакция идёт при высоких концентрациях субстрата:

2 Н₂О_{2 каталаза} 2Н₂О + О₂

НАДФН-оксидаза локализуется на поверхности цитоплазматической мембраны нейтрофила, поэтому в результате её действия большие количества биоцидных веществ оказываются и в промежуточном веществе. В ходе фагоцитоза этот фермент становится частью внутренней поверхности фагосомы и продукты его активности выделяются в её полость, где и оказывают своё бактерицидное действие. Избыток пероксида водорода возникает в цитоплазме благодаря дисмутации супероксидного анион-радикала, который проникает сюда из фагосом и межклеточного пространства.

Открытие явления «дыхательного взрыва» в фагоцитах послужило началом широкого изучения микробицидного действия активных кислородных метаболитов (АКМ) и их роли в защите организма. При этом ярко выявилось, что имеется генетически обусловленное нарушение механизмов генерации АКМ, например, больные с хроническим гранулёматозом и дефицитом миелопероксидазы, а также их ингибирование лекарственными препаратами приводит к снижению неспецифического иммунитета и является причиной либо гибели организма, либо развития хронической патологии.

Исследования, проведённые при хронических септических грануломах показали, что, несмотря на фагоцитирование, бактерии оставались жизнеспособными и сохраняли вирулентность, а поступая с лейкоцитами в различные органы, особенно лёгкие и печень, вызывали там образование хронических очагов воспаления. При анализе этого явления было обнаружено, что причиной потери бактерицидных свойств лейкоцитами является недостаточность НАДФН-оксидазы. При этом не выделяется супероксид анион-радикал и не образуется пероксид водорода, необходимые для бактериолиза внутри фагоцитов. Используя меченный Н₂О₂ обнаружили снижение его содержания почти в три раза. Указанный дефект наследуется рецессивно и сцеплен с Х-хромосомой.

В 1973 году был открыт белковый фактор – так называемый тафтсин, значительно облегчающий фагоцитоз. Общая схема действия этого фактора такова. Тафтсин, синтезированный в печени, соединяется с цитофильным антителом, называемым лейкокинином. После этого лейкокинин соединяется с рецептором лейкоцита и освобождает тафтсин, активирующий фагоцитоз.

Тафтсин – это тетрапептид (треонил – лизил – пролил – аргинин). Клинические формы недостатка тафтсина проявляются рецидивирующими гнойными инфекциями, хроническим лимфоденитом, бронхитами, пневмониями и фурункулёзом.

Расход энергии при фагоцитозе, с учётом роста потребления кислорода, повышения продукции СО₂ и лактата составляет 10⁹ молекул АТФ. При распаде пероксида водорода под действием лактопероксидазы выделяется АФК, которая вместе с рецепторным белком переносится на бактерию и разрушает её оболочку, главным образом, за счёт активации ПОЛ в наружной мембране бактериальной клетки.

Наряду с этим, судьба фагоцита тоже предрешена: при поступлении лизосомальных ферментов в фагосом быстро разрушается её оболочка, после чего всё её содержимое проникает внутрь клетки, вызывая смерть фагоцита. Фагосом называют «мешком самоубийства» фагоцитов. Разрушенные нейтрофильные лейкоциты образуют так называемые гнойные тельца, представляющие собой остатки этих клеток.

Одной из немногих реакций синтеза, протекающих в нейтрофилах, является синтез фосфатидов, особенно во время фагоцитоза. Очевидно, это связано с восстановлением липидных компонентов мембран, утрачиваемых при фагоцитозе.

Кислороднезависимые механизмы фагоцитоза.

Кроме перечисленных восстановленных дериватов кислорода бактерицидное действие обеспечивается ещё рядом факторов. Прежде всего, это высокая концентрация Н⁺, возникающая при диссоциации конечного продукта анаэробного гликолиза (главного поставщика энергии в нейтрофилах) – лактата. В течение нескольких минут фагоцитоза рН в фагосомах снижается до 4-5, что уже само по себе действует бактерицидно на некоторые микроорганизмы. С другой стороны, это создаёт оптимальные условия для действия гидролаз, находящихся в гранулах, которые устраняют погибшие микробные тела. В этом им помогает лизоцим (аминополисахаридаза), который расщепляет полисахиридные цепи протеогликанового слоя клеточной стенки.

Бактерицидным свойством обладает и комплекс основных белков (катионные белки), называемых фагоцитином. Этот комплекс представляет собой смесь пептидов – дефензинов. Дефензины содержат около 30 аминокислотных остатков и составляют 50% катионных белков. Предполагается, что механизм бактерицидного действия дефензинов связан с образованием ионных каналов в цитоплазматической мембране фагоцитируемой клетки. Дефензины реагируют с отрицательно заряженными группами, находящимися на поверхности микробных тел и способствующими натяжению мембраны в результате взаимного отталкивания. При блокировке этих групп мембрана теряет стабильность своей структуры.

Вопреки сложившемуся мнению, процесс фагоцитоза оказался довольно сложным явлением.

Молекулярная расшифровка первого этапа фагоцитоза показала роль процесса иммуноадгеренции, который заключается в образовании комплексов антиген-антитело на поверхности не иммунизированных клеток. Этот процесс играет особую роль в антибактериальном и противовирусном иммунитете, поскольку образованные комплексы антиген-антитело (в данном случае антигеном являются бактерии или вирусы) уничтожаются лейкоцитами. Для иммуноадгеренции необходим активированный комплемент. Однако, для антител, обладающих соответствующими клеточными рецепторами, активация комплемента не нужна.

Молекулярная расшифровка второго этапа – поглощение или захват предварительно связанного с клеточными рецепторами чужеродного агента происходит при участии плазменных факторов, среди которых наиболее важную роль играют антитела – Ig G, вызывающие опсонизацию фагоцитируемого вещества. Сам процесс поглощения требует затраты энергии. Здесь следует отметить, что фагоцитоз – это филогенетически древнее явление, не нуждающееся в наличии митохондриального аппарата, который усовершенствовался позже. Поглощение происходит в условиях анаэробиоза и обеспечивается ограниченной энергетической мощностью гликолиза.

Наконец, молекулярная организация третьего этапа – переваривания, как говорилось выше, требует повышения потребления кислорода и связано с наличием антител, необходимых для опсонизации фагоцитируемых молекул.

Опсонизация – это покрытие бактерий специфическими антителами классов G и М, а также фрагментами комплемента С₃, С₅, С₆, С₇.

Поглощение происходит следующим образом. Чужеродные молекулы, связанные с клеточными рецепторами, втягиваются внутрь клетки за счёт активации Са⁺⁺-атиномиозиновой системы и образования псевдоподий и образуют фагосом. С этого момента действует механизм дегрануляции: фагосом сливается с лизосомой, образуя фаголизосом, и начинают переваривать поглощённое вещество, образуя вторичный лизосом. Для этого слияния необходимо окисление лизосомальной оболочки, что осуществляется деятельностью НАДФН-осидазы.

Следует обратить внимание, что все антиоксиданты, оказывают защитное действие на лизосомальные оболочки.

Рассмотрим состояние молекулярных механизмов фагоцитоза при некоторых патологических состояниях.

Бактериальный шок

При шоке чрезмерное накопление лактата приводит к снижению скорости гликолиза за счёт повышения уровня НАДН+Н⁺, что оказывает тормозящее действие на фагоцитоз, поглощение и лизосомальное окисление. Понижение резистентности к инфекциям обусловлено и резким падением показателя опсонинов в плазме, так и вялым контактом между бактерией и фагоцитарной гипоксической клеткой.

В проведённых нами исследованиях активности миелопероксидазной системы в лейкоцитах периферической крови у больных с разными формами пиелонефрита установлено, что степень энзиматических нарушений в лейкоцитах больных тем выше, чем тяжелее протекает воспалительный процесс. Нами разработан способ, который позволяет использовать определение активности глюкозо-6-фосфатазы и миелопероксидазы в лейкоцитах периферической крови как дополнительный метод ранней диагностики острого гнойного пиелонефрита.

В наших исследованиях у детей с острым гастроэнтероколитом установлено, что степень повышения активности глюкозо-6-фосфатазы в лейкоцитах периферической крови также тем выше, чем тем тяжелее протекает воспалительный процесс. Разработанный способ прогнозирования осложнённого течения гастроэнтероколита позволяет использовать определение активности глюкозо-6-фосфатазы для прогнозирования развития осложнений кишечной инфекции до проявления клинических симптомов этих осложнений.

Роль АФК в патогенезе и лечении острого и хронического панкреатита

Показано, что важным звеном в патогенезе панкреатита, независимо от этиологии, является так называемый окислительный стресс и возникающее в результате повреждение тканей. В крови резко повышается концентрация АФК и уровень ПОЛ, наблюдается истощение запасов аскорбиновой кислоты, обладающей антиоксидантыми действием. При воспалительном процессе нейтрофилы, будучи носителями готового эффекторного потенциала и обладая способностью к быстрой реализации, быстро включаются в механизм воспаления. В течение нескольких секунд после активации нейтрофилов уровень продукции АФК увеличивается более чем в 100 раз. Системная активация нейтрофилов под воздействием системы комплемента, активированного выходом трипсина, способствует прогрессированию панкреатита и развитию осложнений – в частности поражению лёгких. Это приводит к соответствующим изменениям гомеостаза, а также к росту сосудистой проницаемости, нарушению кровоснабжения органов и тканей.

С одной стороны, индуцируемаыенейтрофилами АФК и лейкотриены вызывают агрегацию тромбоцитов, а с другой – продукты активации тромбоцитов, такие как серотонин, эпинефрин, АДФ, АТФ усиливают адгезивные свойства нейтрофилов. Присутствие тромбоцитов индуцирует хемотаксис нейтрофилов, а также генерацию ими АФК.

Помимо усиления продукции АФК при панреатитах наблюдаются и другие проявления окислительного стресса: повышение уровня МДА, снижение содержания аскорбиновой кислоты, повышение активности фосфолипазы А₂ и эластазы сегментоядерных лейкоцитов. Активация ферментов антиоксидантной защиты – СОД, каталазы, ГПО наблюдается на начальных стадиях заболевания, затем активность их снижается.

Использование в качестве терапевтического воздействия антиоксидантнов снижает тяжесть морфологических проявлений панкреатита, однако, этот эффект проявляется лишь на ранних стадиях в фазе острого отёка поджелудочной железы.

Для борьбы с проявлениями окислительного стресса больные должны получать достаточное количество аскорбиновой кислоты и α-токоферола.

Особо следует в этом контексте подчеркнуть возможность и перспективность применения селективных блокаторов Н₂-гистаминовых рецепторов. Известно, что высокие концентрации гистамина вызывают усиление продукции АФК в нейтрофилах за счёт активации НАДФН-оксидазы. По данным зарубежных авторов Н₂-блокаторы подавляют генерацию супероксидного анион-радикала в нейтрофилах, блокируют реакции, катализируемые миелопероксидазой. При этом улучшаются реологические свойства крови, блокаторы подавляют усиленную генерацию АФК в нейтрофилах, не влияя на их хемотаксис и фагоцитоз, что особенно важно, так как организм не остаётся беззащитным перед инфекцией. Действие Н₂-блокаторов опосредованно через мембранные структуры живых клеток.

Одним из представителей семейства селективных блокаторов гистаминовых рецепторов третьего поколения является фамотодин (квамотел). Однократная инфузия препарата вызывает снижение уровня генерации АФК нейтрофилами крови. В концентрации 2 мг/мл подавляет генерацию АФК в ответ на индукторы респираторного взрыва, причём этот ответ имеет выраженный дозозависимый характер.

Роль АФК в патогенезе ревматоидного артрита

Активация моно- и полинуклеарных фагоцитов сопровождается высвобождением внутриклеточных ферментов, в частности ксантиноксидазы, МПО и протеаз. У больных с ревматоидным артритом выявлено 50-кратное увеличение активности ксантиноксидазы в сыворотке крови, при этом содержание восстановленных SH-групп снижалось в среднем также на 50%. Между содержанием в сыворотке ксантиноксидазы и восстановленных SH-групп показана обратная зависимость с коэффициентом корреляции r = +0,73. При культивировании в течение 24 часов нейтрофилов крови больных ревматоидным артритом наблюдалась быстрая дегрануляция и высвобождение МПО (в культуральной среде клеток больных выявлялось 26,6% МПО, в то время как в нейтрофилах здоровых людей – меньше 2,9%). Высвобождающиеся при активации фагоцитов протеазы и АКМ могут вызывать окислительное повреждение хондроцитов. В частности, обнаружено, что Н₂О₂ ингибирует гликолиз, что приводит к нарушению энергетики клеток. Добавление ксантиноксидазы и гипоксантина к культуре хондроцитов кролика ингибировало размножение клеток и снижало синтез коллагена. Кислородные радикалы также усиливали цитологическое действие на клетки трипсина и коллагеназ.

У больных ревматоидным артритом выявлен повышенный уровень метаболитов оксида азота, в частности нитрита (NO₂^-), как в плазме, так и в синовиальной жидкости, что свидетельствует об активации NO-синтазы.

В экспериментальных исследованиях на крысах с индуцированным артритом также показано повышение содержания метаболитов NO˙ в сыворотке и моче. Какие клетки отвечают за синтез NO-радикалов строго не установлено. В хондроцитах выявлена и охарактеризована NO-синтаза II типа, которая индуцируется интерлейкином-1 и другими цитокинами. Продуцентами NO˙ могут выступать фагоцитарующие клетки, мигрирующие в синовиальную жидкость. Показана прямая корреляция между ингибированием нитерлейкином-1 синтеза компонентов матрикса хряща и продукцией NO-радикалов. Свидетельством патофизиологической роли NO˙ является положительный эффект применения ингибиторов NO-синтазы, которые не только сглаживают симптомы и проявления, а иногда и предотвращают развитие артритов.