Лекция 2б Матричные биосинтезы (ПЦР, апоптоз)

ДНК-диагностика (ПЦР)

Для выявления дефектов в структуре ДНК она должна быть выделена из соответствующего источника (биологическая жидкость, культура клеток, биоптат) и «набрана» в количестве достаточном для исследования.

Для генетико-терапевтических работ необходимо выделение нормальных генов и введение их в дефектные клетки, таким образом, чтобы с них образовывалось РНК (экспрессия генов).

ДНК может быть выделена из любого типа клеток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования, ферментативное расщепление белков Ԑ-протеиназами и экстрагирование ДНК из раствора с помощью фенола и хлороформа. Затем ДНК осаждают этанолом и после удаления над осадочной жидкости растворяют в буферном растворе.

Оценку качества экстрагированной ДНК проводят на основании измерения оптической плотности раствора ДНК при λ = 280 и λ = 260 нм. Для чистых образцов соотношение 260/280 – должно быть больше 1,8.

Полученные молекулы ДНК меньше исходных, но все равно они очень большие и не удобны для исследований, поэтому их необходимо дополнительно фрагментировать. Для фрагментирования используют ферменты – рестриктазы (эндонуклеазы). Эти ферменты выделяют из бактериальных клеток. Ԑ-рестриктаза расщепляет внутренние участки ДНК на небольшие фрагменты.

С помощью набора рестриктаз ДНК разрезают на фрагменты ≈ 300 пар нуклеотидов (короткие одноцепочечные фрагменты или двуцепочечные). Эти фрагменты ДНК разделяют методом электрофореза в полиакриламидном (или агарозном) геле. Затем их прокрашивают в геле. Идентификация нужных фрагментов ДНК в геле возможна только путем гибридизации с мечеными ДНК-зондами. ДНК-зонды синтезируют на автоматических машинах.

ДНК-зонд – это одноцепочечная нить ДНК, содержащая более 100 нуклеотидов в строго определенной последовательности. Из геля выделяют нужный фрагмент ДНК, который необходимо амплифицировать (увеличить количественно в миллионы раз). Для этого необходимо провести полимеразную цепную реакцию (ПЦР) in vitro, которая позволит накопить необходимое количество исследуемого фрагмента ДНК.

Метод ПЦР основан на реакции синтеза ДНК при действии Ԑ-ДНК-полимеразы.

Инкубационная смесь для ПЦР содержит буферный раствор, препарат фрагментированной ДНК, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, Ԑ-ДНК-полимеразу и две разные затравки.

Затравка – это одноцепочечная ДНК длиной 20 нуклеотидов, позволяющая найти нужный ген. Затравки в ПЦР функционируют как собственные затравки, как зонды, обнаруживают и метят изучаемую последовательность ДНК.

ПЦР позволяет накопить необходимое количество ДНК при очень малых исходных количествах биологического материала. Часто ПЦР применяют для диагностики инфекционных болезней. Метод основан на том, что первичная структура ДНК разных видов микроорганизмов различна.

Следовательно, используя банк затравок, подбирают затравки, которые гибридизируются с ДНК возбудителя, но не с ДНК человека.

Если использовать эти затравки и провести ПЦР с материалом (кровь, биопсийный материал), полученный от больного, то нарастание количества ДНК в пробе будет указывать на наличие возбудителя в организме пациента: в ПЦР будет синтезироваться только ДНК возбудителя, а не пациента.

Вирусы, для которых характерен длительный латентный период (например, ВИЧ), трудно обнаружить на ранних стадиях. С помощью ПЦР это удается сделать, когда вирус содержится в незначительной части клеток организма.

Апоптоз

Апоптоз - процесс запрограммированной гибели клеток.

Процесс апоптоза включается при наличии внешних и внутренних факторов. К внешним факторам относят:

- токсические вещества;

- свободно радикальное окисление;

- нарушение кровообращения;

- вирусы.

К внутренним факторам относят:

- повреждение генома;

- мутации клеток.

Эти изменения активируют ряд специфических протеаз (специфические протеолитические Ԑ-каспазы (инициирующая и элонгационная)), которые активируют Ԑ-ДНК-эндонуклеазы.

ДНК-эндонуклеазы гидролизуют ДНК сначала на крупные фрагменты (50000 нуклеотидов), а затем на более мелкие (180 нуклеотидов – размер участка ДНК в одной нуклеосоме). Далее клетка распадается на мембранные везикулы (апоптозные тельца), содержащие фрагментированную ДНК. Эти везикулы поглощаются и разрушаются фагоцитирующими клетками. Таким путем устраняются клетки, размножение которых может быть опасным для организма, например, привести к развитию опухоли. Это путь внутреннего апоптоза.

Другая форма апоптоза – естественная гибель клеток в эмбриогенезе (плацента, урахус, желточный мешок). Эта форма апоптоза нужна для смены популяции клеток на разных стадиях эмбриогенеза.

Таким образом апоптоз – это гибель клеток, обусловленная нарушением репарации ДНК.

Биологическое значение апоптоза:

1. Нормализация развития организма в период эмбриогенеза. Врожденные дефекты возникают из-за недостаточности апоптоза.

2. Предотвращение размножения мутирующих клеток.

3. Регуляция иммунной системы.

4. Предотвращение старения организма.

Апоптоз имеет ключевое значения для завершения развития организма, заменяя старые клетки на новые.

Существует и другая форма гибели клеток – некроз.

Некроз – это гибель клеток в живом организме под действием высоко-агрессивных факторов (травма, нарушение кровотока, тромбоз сосуда). При некрозе нарушается процесс апоптоза. Некроз проявляется набуханием клетки, сопровождающимся разрушением клеточной мембраны, в том числе – мембраны лизосом. Содержимое клетки оказывается в межклеточном пространстве. Освободившиеся Ԑ-лизосомы гидролизуют полимеры поврежденной клетки, а также соседних клеток и межклеточного матрикса. Продукты распадающихся клеток вызывают воспалительную реакцию.

При некрозе, в отличие от апоптоза, всегда происходит нарушение целостности клеточной мембраны и выход Ԑ-гиролаз из клетки.