Методические рекомендации к практическим занятиям для обучающихся на 22-23 учебный год

УДК 611-013-018(07)

ББК 28.705.706я7 Л 12

Рецензенты:

Зав. кафедрой морфологии и физиологии человека и животных ФГБОУ ВО БГУ д.б.н. проф Хисматуллина З.Р.

И.о. зав кафедрой морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней ФГБОУ ВО БГАУ проф., д.в.н. Сковородин Е.Н.

Л 12 Лабораторные занятия по цитологии, эмбриологии и гистологии: уч.

пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальности 31.05.02

–Педиатрия / сост.:

Ф. А. Каюмов, Х. Х. Мурзабаев, М. Я. Фазлыахметова. – Уфа: Изд-во ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития

России, 2021-22 г.- 172 с.

В учебном пособии использованы микрофотографии д. м. н., профессора Ф. А. Каюмова.

Практикум по цитологии, эмбриологии и гистологии предназначен студентам для подготовки к практическим и итоговым занятиям, а также государственным экзаменам.

Печатается по решению Координационного методического совета Башгосмедуниверситета для образовательного процесса в ГБОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Учебно-методическое объединение по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России рекомендует в качестве учебного пособия для внутривузовского применения.

УДК 611 – 013 – 018 (07)

ББК 28. 705. 706 я 7

© ФГБОУ ВО БГМУ Минздравсоцразвития России, 2022

2

3

ВВЕДЕНИЕ

Учебное пособие составлено в соответствии с Государственным образовательным стандартом высшего профессионального образования и типовой Учебной программой по дисциплине «Гистология, цитология и эмбриология».

Цель. Целью освоения дисциплины «Гистология, цитология и эмбриология» является формирование у студентов научных представлений о микроскопической функциональной морфологии и развитии клеточных, тканевых и органных систем человека, обеспечивающих базис для изучения клинических дисциплин и способствующих формированию врачебного мышления.

Место дисциплины.

Дисциплина «Гистология, цитология и эмбриология» относится к математическому, естественнонаучному, медико-биологическому циклу дисциплин высшего профессионального медицинского образования. Основные знания, необходимые для изучения дисциплины формируются в цикле математических, естественнонаучных, медико-биологических дисциплин, наряду с биологией, физикой, общей химией, органической биологической химией, анатомией человека, нормальной физиологией. Изучение дисциплины «Гистология, цитология и эмбриология» предшествует дисциплинам: патологической анатомии, патологической физиологии, фармакологии, топографической анатомии, дисциплинам профессионального цикла.

Требования к знаниям и умениям.

В результате освоения дисциплины студент должен:

знать: химико-биологическую сущность процессов, происходящих в живом организме на молекулярном и клеточном уровнях; основные закономерности развития и жизнедеятельности организма человека на основе структурной организации клеток, тканей и органов; гистофункциональные особенности тканевых элементов; методы их исследования;

уметь: пользоваться учебной, научной, научно-популярной литературой, сетью Интернет для профессиональной деятельности; пользоваться лабораторным оборудованием; работать с увеличительной техникой при изучении гистологических, цитологических, иммуногистохимических препаратов; анализировать гистофизиологическое состояние различных клеточных, тканевых и органных структур человека;

владеть: медико-функциональным понятийным аппаратом; навыками постановки предварительного диагноза на основе результатов лабораторного и гистологического исследования.

Процесс изучения дисциплины «Гистология, цитология и эмбриология» направлен на формирование ряда компетенций, в том числе:

4

-способности и готовности анализировать социально-значимые проблемы и процессы, использовать на практике методы гуманитарных, естественнонаучных, ме- дико-биологических и клинических наук в различных видах профессиональной и социальной деятельности ;

-способности и готовности анализировать закономерности функционирования отдельных органов и систем, использовать знания анатомо-физиологических основ, основные методики клинико-иммунологического обследования и оценки функционального состояния организма взрослого человека и подростка для своевременной диагностики заболевания и патологических процессов.

Образовательные технологии:

-работа студентов с литературой;

-поиск учебной и научной информации в Интернете;

-подготовка рефератов;

-подготовка выступлений с использованием мультимедийных презентаций

5

Предмет и задачи гистологии и цитологии

Основы гистологической техники. Цитология.

Гистология человека – фундаментальная медико-биологическая наука, изучающая микроскопическое строение и жизнедеятельность тканей, образующих его тело. В более широком смысле, предмет ее изучения охватывает также микроскопическое строение и жизнедеятельность органов человека. Гистология как наука и как учебная дисциплина традиционно объединяет два раздела: общую гистологию и частную гистологию.

Общая гистология изучает основные, фундаментальные свойства важнейших групп тканей.

Частная гистология человека изучает особенности структурнофункциональной организации и взаимодействия тканей в составе конкретных органов.

Курс гистологии в медицинском ВУЗе включает в себя учение о клетке – цитологию, а также учение о пренатальном развитии организма – эмбриологию.

Цитология – наука о закономерностях строения, развития и жизнедеятельности клетки. Современные гистология и цитология представляют собой не сугубо морфологические, а морфофункциональные научные дисциплины.

Гистология и цитология в настоящее время являются важной частью медицинского образования. Они создают основу для изучения других фундаментальных меди- ко-биологических дисциплин (физиологии, биохимии, патологической физиологии, иммунологии, фармакологии).

Вместе с тем, понимание причин, механизмов и следствий заболеваний все в большей степени основывается на знании гистологии, ультраструктуры и биологии клетки. Поэтому правильные представления о структурно-функциональной организации клеток и тканей человека, а также об их участии в важнейших механизмах биологических процессов создает основу для понимания патогенеза и морфогенеза заболеваний человека. Современная гистология и цитология обеспечивают необходимый базис для успешного освоения клинических предметов и выполняет роль интегративных наук, осуществляющих связь между медико-биологическими и клиническими дисциплинами и способствующих формированию врачебного мышления.

Данные гистологических и цитологических исследований все более широко используются в клинической диагностике различных заболеваний. Оценка характера изменений строения клеток, тканей и органов при патологических процессах, осуществляемая в ходе диагностических гисто- и цитопатологических исследований, требует глубокого знания их нормального строения. Внедрение в медицинскую практику но-

6

вых морфофункциональных методов, основанных на достижениях современной иммунологии и молекулярной биологии, еще в большей степени повышает эффективность и диагностическую ценность цито-гистологических методов.

Настоящее методическое пособие составлено для студентов лечебного и медикопрофилактического факультетов Башгосмедуниверситета.

На практических занятиях студент изучает структурную организацию клеточных элементов, тканей и органов на данном препарате, при этом студенты производят зарисовку препарата и обозначение на рисунке всех основных элементов.

Во время работы с микропрепаратами преподаватель оказывает индивидуальную помощь студентам в усвоении учебных элементов препарата.

В конце практического занятия преподаватель проверяет правильность проделанной работы студентов на альбомах.

Основы гистологической техники.

Для приготовления гистологических препаратов взятые кусочки тканей и органов должны пройти следующие этапы проводки: 1 - взятие материала, 2 - фиксация, 3

-промывание, 4 - обезвоживание материала, 5 - уплотнение, 6 - изготовление срезов, 7

-окрашивание срезов, 8 - обезвоживание, 9 - просветление, 10 - заключение.

1.Взятие материала. Для приготовления гистологических препаратов материал берут от животных, умерщвленных для этой цели, от животных и людей во время операции (биопсия) и от трупов.

2.Фиксация проводится для сохранения прижизненной структуры ткани и кусочков органов путем быстрой коагуляции ее белков. Различают простые фиксаторы (чаще всего 10% формалин) и сложные (смесь Ценкера, Буэна, Мюллера и др.). Вырезанный кусочек или орган следует тотчас же опускать в заранее приготовленную фиксирующую жидкость. Количество фиксирующей жидкости должно в 20-30 раз превосходить объем кусочка. Срок фиксации тканей в формалине 24-48 часов. В большинстве случаев фиксация производится при комнатной температуре. Размер исследуемых кусочков должен быть не более 1×1 см. Фиксирующие растворы следует готовить непосредственно перед их употреблением.

3.Промывание. По окончании фиксации объекты промывают водой для удаления фиксатора и артефактов. Промывка длится до 1-2 суток.

4.Обезвоживание материала. При этом взятые кусочки тканей последовательно обрабатывают спиртом возрастающей концентрации (70 %, 80 %, 96 %, 100 %) в каждом растворе по 24 часа. Вслед за обезвоживанием в спиртах следует заливка материала в специальные плотные среды (парафин).

5.Уплотнение. Схема заливки в парафин:

7

1.Обезвоживание в спиртах 70 %, 80 %, 96 % и абсолютный спирт по 24 часа в

каждом.

2.Погружение объекта в смесь равных частей абсолютного спирта и ксилола на 1-3 часа.

3.Перенос объекта в чистый ксилол на 3 часа.

4. Погружение в раствор парафина в ксилоле при температуре

37 градусов на 2 часа.

5.Перенос в 1-й чистый парафин на 2 часа при температуре термостата 56 гра-

дусов.

6.Перенос во 2-й чистый парафин на 1-2 часа при 56 градусов.

7.Заливка материала чистым парафином в бумажных формочках.

8.Наклеивание на деревянные кубики.

6. Изготовление срезов производится на санном микротоме толщиной 7-10 мкм. Предварительно предметные стекла очищают от грязи и обезжиривают их поверхность. Для того чтобы парафиновые срезы можно было подвергнуть дальнейшей обработке, их необходимо наклеить на предметное стекло в расправленном положении. Клеевой основой для предметных стекол служит белок куриного яйца с глицерином в равных количествах по объему. Предварительно срезы переносят в теплую воду для расправления, затем смазанное белком с глицерином предметное стекло подводят

внаклонном положении под плавающий срез.

7.Окраска препаратов. Различная кислотность субстрата клетки обеспечивает избирательное отношение частей клетки к красителям. Структуры, имеющие кислую реакцию, обладают сродством к основным красителям, поэтому их называют базофильными (базофильны ядра клеток, цитоплазма белоксинтезирующих клеток). Свойство окрашиваться основными красителями – базофилия. Структуры, щелочной реакцией обладают сродством к кислым красителям (оксифилия) и называются оксифильными (цитоплазма большинства клеток, волокна межклеточного вещества). Окраска гематоксилин - эозином наиболее распространенный метод окрашивания срезов. Гематоксилин окрашивает ядро в синий цвет, тогда как эозин окрашивает цитоплазму в красный цвет. Гематоксилин представляет собой экстракт древесины кампешевого дерева. Эозин – искусственная краска.

Схема окраски гематоксилин-эозином парафиновых срезов:

- Срезы, подлежащие окраске, нужно освободить от пропитывающего их парафина в 2-х порциях ксилола – 4-5 мин.

- Удалить из срезов ксилол в 100 градусном спирте – 2-3 мин. - Выдержать срезы в 96 % спирте – 2-3 мин.

8

-Выдержать срезы в 70 % спирте – 2-3 мин.

-В воде дистиллированной – 1-2 мин.

-Окраска гематоксилином – 3-5 мин.

-Сполоснуть в водопроводной воде.

-Окрасить эозином – 1 мин.

-Промыть в воде.

8.Обезвоживание окрашенных срезов в спиртах возрастающей крепости по 1-

2 мин.

9.Просветление в ксилоле 1-2 мин.

10. Заключение. Осуществляется путем нанесения бальзама на срез и осторожным покрытием препарата покровным стеклом. После высушивания гистологический препарат готов для изучения.

Количественная оценка клеточных и тканевых структур.

Морфометрические методы представляют собой совокупность приемов, позволяющих дать количественную оценку параметров клеточных и тканевых структур на гистологических и цитологических препаратах (или их фотографиях). Путем использования этих методов определяют такие параметры, как, например, диаметр, высоту, толщину, площадь сечения, количество объектов на единице площади, их форму

идр. При морфометрии объектов на гистологических препаратах необходимо учитывать, что оцениваемые параметры относятся не к собственно тканевым компонентам, а к сечениям на срезах. Морфометрические методы могут использоваться при изучении объектов не только под световым микроскопом, но и на электронномикроскопическом уровне.

Стереологические методы, в отличие от стандартных морфометрических, позволяют путем специальных приемов и расчетов определить истинные (трехмерные) параметры объектов (например, их относительный объем, содержание в единице объема

идр.), исходя из оценки на срезах их линейных и плоскостных параметров.

Ручная морфометрия основана на проведении подсчетов визуально, непосредственно под микроскопом или на микрофотографиях с использованием линеек, сеток (в том числе в виде окулярных вставок) и других приспособлений.

Методы полуавтоматического и автоматического анализа изображения с применением компъютеров получили широкое распространение благодаря своей высокой производительности. Они позволяют быстро количественно оценить большое число признаков на изучаемом препарате и по их совокупности идентифицировать различные структуры (например, типы клеток по распределению хроматина в их ядрах).

Приборные микроскопические методы для количественной оценки гисто-

9

химических и иммуногистохимических реакций.

Цитофотометрия – количественный приборный метод, дающий возможность оценить содержание исследуемого вещества в структурных элементах тканей и клеток. Измерения производятся на специальном приборе – цитофотометре – путем оценки оптической плотности окрашенного изучаемого вещества гистохимической реакцией в пределах определенной площади препарата (зонда) при длине световой волны, соответствующей максимуму поглощения использованного красителя. При измерении содержания ДНК полученные данные сопоставляют с результатами измерений в заведомо диплоидных клетках (например, в покоящихся лимфоцитах), что позволяет оценивать результаты в единицах плоидности.

Проточная цитометрия, или флоу-цитометрия (от англ. flow – поток) – высо-

коэффективный приборный количественный метод оценки содержания веществ в клетках, находящихся в суспензиях.

Подготовка клеток к анализу заключается в их окрашивании с использованием флюоресцирующих красителей в цитохимических или иммуноцитохимических реакциях. В последнем случае красители конъюгированы со специфическими антителами. При работе с тканями их предварительно обрабатывают ферментами для разрушения межклеточных связей и получения клеточных суспензий.

Окраска клеток флюоресцирующими красителями используется для маркировки искомого вещества. Некоторые вещества можно непосредственно выявить путем цитохимической реакции с избирательно связывающимся с ними красителем (например, ДНК с помощью бромида этидия). Для маркировки вещества клетки обрабатывают специфическими антителами, с которыми конъюгированы флюоресцирующие красители. При этом маркированные антитела связываются с соответствующими клеточными антителами (веществами) в результате иммуноцитохимической реакции.

Проточный цитометр (флоу-цитометр) с высокой скоростью пропускает суспензию окрашенных клеток через узкую капиллярную трубку, освещенную лучом лазера. Уровень флюоресценции каждой клетки или ее ядра (соответствующий содержанию исследуемого вещества) последовательно регистрируется с помощью специальных детекторов со скоростью до нескольких десятков тысяч клеток в 1 мин. С построением соответствующих гистограмм (графиков распределения) содержания веществ. В некоторых случаях через капилляр пропускают неокрашенные клетки (форменные элементы крови) и оценивают распределение их размеров и формы.

Клеточная сортировка позволяет выделить клетки с определенными маркерными признаками (или их сочетанием) из клеточной суспензии. Процедура реализуется с использованием специального прибора – сортера (клеточного анализатора), рабо-

10