12 Билет:
Что такое культура клеток? Их разновидности и основные различия.
Культура клеток – это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro). Методика культивирования клеток особенно успешно стала развиваться после 40-х годов текущего столетия. Этому способствовали следующие обстоятельства: открытие антибиотиков, предотвращающих бактериальное заражение культур клеток, открытие Хуангом (1943) и Эндерсом (1949) способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток (цитопатический эффект) – удобный метод индикации вирусов в культурах клеток, и, наконец, Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и получения однослойных культур клеток. В вирусологической практике применяют следующие культуры клеток:
Первичные культуры клеток — это клетки какой-либо ткани человека или животного, способные культивироваться в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности в специальной питательной среде, но не способные к длительному размножению. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.
Диплоидные культуры клеток — клетки одного генотипа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные линии фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин.
Перевиваемые клеточные линии характеризуются бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры, отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению в клетках таких свойств, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными. Другой источник перевиваемых клеточных линий — злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo.
Для обеспечения жизнедеятельности культивируемых клеток необходимы питательные среды. По назначению они делятся на ростовые и поддерживающие. В ростовых питательных средах должно содержаться больше питательных веществ, обеспечивающих активное размножение клеток и формирование монослоя. Поддерживающие среды обеспечивают переживание клеток в уже сформированном монослое в период размножения в них вирусов.
Бактериофаги. Морфология и химический состав.
Бактериофа́ги или фа́ги — вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Бактериофаг присутствует там, где находятся чувствительные к нему бактерии. Размеры – 20 – 200 нм. Большинство фагов имеют форму головастиков (имеют кубоидную симметрию – головка, и спиральную симметрию – тельце). Наиболее сложно устроенные фаги состоят из многогранной головки, в которой располагается нуклеиновая кислота, шейка и отростки. На конце отростка располагается базальная пластинка, с отходящими от нее нитями и зубцами. Эти нити и зубцы служат для прикрепления фага к оболочке бактерии. У наиболее сложноорганизованных фагов в дистальной части отростка, содержится фермент – лизоцим. Этот фермент способствует растворению оболочки бактерий при проникновении фаговой НК в цитоплазму. У многих фагов отросток окружен чехлом, который у некоторых фагов может сокращаться. Тип симметрии: смешанный – голова кубической симметрии, тело спиральной.
Различают 5 морфологических групп
1. Бактериофаги с длинным отростком и сокращающимся чехлом
2. Фаги с длинным отростком, но не сокращающимся чехлом
3. Фаги с коротким отростком
4. Фаги с аналогом отростка
5. Нитевидные фаги
Химический состав.
Фаги состоят из нуклеиновой кислоты и белков. Большинство из них содержит 2хнитевую ДНК, замкнутую в кольцо. Некоторые фаги содержат одну нить ДНК или РНК. Оболочка фагов – капсид, состоит из упорядоченных белковых субъединиц – капсомеров. У наиболее сложноорганизованных фагов в дистальной части отростка, содержится фермент – лизоцим. Этот фермент способствует растворению оболочки бактерий при проникновении фаговой НК в цитоплазму. Фаги хорошо переносят замораживание, нагревание до 70, высушивание. Чувствительны к кислотам, УФ и кипячению. Фаги инфицируют строго определенные бактерии, взаимодействую со специфическими рецепторами клеток.
Европейская чума свиней (ЕЧС, КЧС).
Pestis suum - вирусная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, поражением кровеносных сосудов и кроветворных органов, крупозно-дифтеритич. воспалением слизистой оболочки толстых кишок. Регистрируется во всех странах. Вирус рода Pestivirus сем. Flaviviridae, РНК его вириона заключена в белковый капсид, покрытый липидным слоем. Вирионы представляют собой сферические частицы диаметром 40 – 60 нм. Источник возбудителя инфекции — больные свиньи, выделяющие вирус во внешнюю среду с мочой, фекалиями, а также с секретами. Факторы передачи возбудителя — загрязнённые выделениями больных корма, вода, подстилка, навоз и др. Заражение свиней чаще происходит через пищеварительный тракт, органы дыхания, реже через повреждённую кожу.
Вирус обладает значительной устойчивость: в охлажденных мясных продуктах сохраняется 2 – 4 мес, в замороженных – несколько лет, в солонине – более 10 мес. Прямой солнечный свет убивает его на поверхности почвы через 3 – 5 дней. В разлагающихся трупах, навозе погибает через 3 – 5 дней, в садовой земле – через 7 – 13 дней. В свинарниках не теряет вирулентность в течение года. В сыворотке крови от больных свиней при 37С активность вируса сохраняется в течение 11 дней, и полная инактивация наступает через 18 – 20 суток. При 60С вирус инактивируется через 10 мин, при кипячении – моментально.
Культивирование: биопроба на поросятах в возрасте 2 – 3 месяцев массой 20 – 30 кг используется для диагностики КЧС и выделения вируса. Выделение вируса с использованием перевиваемой культуры клеток.
Пат.мат: От погибших или вынужденно убитых животных берут пробы крови, ткани сердца, легких, печени, селезенки, почек, миндалин и лимфоузлов.
Инкубационный период длится 3 – 7 дней, реже – 2 – 3 нед. Сверхострое - Эта форма характерна для поросят. Животное погибает буквально через несколько дней. Рвота - наиболее характерный признак, и именно на него обращают внимание в первую очередь, Пятна на коже ярко-красного цвета, сильное повышение температуры тела.
Острое – темп. 41,5 – 42С,угнетение, слабость, отказ от корма, рвоту. Заболевшие животные больше лежат,походка у них шаткая. Развиваются конъюнктивит, ринит, появляются запор, а затем понос, иногда кровавый. Супоросные матки абортируют. Иногда наблюдают кровотечение из носа и нервные расстройств. На коже ушей,живота, внутренней поверхности бедер возникают кровоизлияния, образуют темно-багровые пятна, не бледнеющие при надавливании. Нервная форма относится к острой. При этом наблюдаются судорожные подергивание групп мышц, параличи конечностей, нервные возбуждения и апатия, смерть на 24-48ч.
Подострое - длится 2 – 3 нед, типичные признаки выражены слабее. Развитие вторичных инфекций появляются признаки крупозно-некротического энтероколита (извращенный аппетит, запоры, поносы) и поражения легких (истечения из носовой полости, одышка, кашель, пневмония).
Хронич. - болезнь затягивается до 2 мес. У животных отмечают периодические поносы, переменчивый аппетит, кашель. Характеризуется тяжелыми крупозно-дифтероидными поражениями желудочно-кишечного тракта, гнойно-фибринозным воспалением легких и плевритом. У больных животных наблюдают отсутствие аппетита, конъюнктивит, анемия и исхудание.
Переболевшие свиньи приобретают стойкий пожизненный иммунитет. Вакцина есть. Человек не болеет.
РНГА используется для обнаружения антигенов вируса в патологическом материале. Для обнаружения специфических антител к вирусу КЧС в лабораторной практике используются три метода: реакция нейтрализации флюоресцирующих микробляшек (РНФБ), реакция непрямой ИФ и непрямой вариант твердофазного ИФА.