10. билет:

1. Цитопатическое действие вирусов, его проявление и практическое использование.

Цитопатическое действие - специфич. морфологич. деструкция (разрушение) и функциональная патология заражённых вирусами клеток, культивируемых вне организма (если проще, то любое изменение в КК). Индикация вирусов в культуре клеток осуществляется, прежде всего, по цитопатическому действию (ЦПД) вирусов, сроки и характер которого зависят от свойств вируса, проявляясь дегенеративными изменениями клеток с последующей их гибелью и отслаиванием от стекла. Полная дегенерация клеток сопровождается значительными изменениями в виде сморщивания ядра и цитоплазмы, отслаиванием клеточного монослоя от стекла. Частичная дегенерация культур кл. может протекать по следующим типам:

1. гроздеобразования (округление, увеличение и слияние клеток с образованием гроздевидных скоплений, типично для аденовирусов),

2. очаговой деструкции (очаги пораженных клеток на фоне в целом сохранившегося монослоя), характерной для вирусов гриппа;

3. симпластообразования (слияние кл. с образованием гигантских многоядерных клеток в виде симпластов или синцитиев, характерных для вирусов кори, паротита, парагриппа, респираторно-синцитиального, герпеса, иммунодефицита человека).

4. Пролиферативный тип ЦПД с трансформацией клеток в злокачественные, обладающие неограниченными потенциями к росту, способны вызывать онкогенные вирусы (вирус папилломы человека (ВПЧ), вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), вирусы гепатита В и С, вирус Т-клеточного лейкоза/лимфомы).

Сроки, в течение которых наступает ЦПД, вариабельны (например, 1-2 дня у полиовирусов, 7-14 суток у аденовирусов). Если в инфицированных культурах клеток ЦПД отсутствует или слабо выражено, проводят «слепые пассажи», т.е. заражают культуральной жидкостью новые культуры клеток. Также можно использовать реакцию интерференции: исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.

2. Патогенез вирусных инфекций

Патогенез вирусных инфекций — это совокупность процессов, вызывающих вирусное заболевание и определяющих его развитие и исход. Патогенность вирусов обеспечивается их способностью проникать внутрь клетки, нарушать в ней обмен веществ, изменять клеточные мембраны, индуцировать иммунные реакции на инфицированные клетки. Патогенез вирусного заболевания определяется следующими факторами: 1. Избирательностью (тропизмом). 2. Интенсивностью фиксации вируса на клетке (адсорбцией), скоростью размножения вируса и количеством инфекционных частиц в потомстве. 3. Реакцией клетки на инфекцию. 4. Реакцией организма на вызванные вирусом изменения клеток или тканей.

Основные этапы: 1. Проникновение вируса в организм. Основные входные ворота для возбудителей вирусных инфекции человека — дыхательные пути и ЖКТ, реже — кожные покровы. 2. Локальные поражения вирусами типичны для возбудителей респираторных и кишечных инфекций, а также для некоторых кожных заболеваний. Продолжительность инкубационного периода большинства подобных инфекций составляет 2-3 сут. Первичную репликацию часто сопровождает вирусемия. Она обычно протекает бессимптомно или по типу продромальных явлений, но может возникать и на фоне выраженной клинической картины, не вызывая развития дополнительной симптоматики. В дальнейшем возможно несколько вариантов:

• полная элиминация возбудителя (абортивная инфекция);

• размножение вирусов в фагоцитах с последующим выходом и развитием выраженной вторичной вирусемии, сопровождающейся появлением характерных клинических признаков заболевания (например, энцефалитов);

• некоторые вирусы (например, вирус гепатита В, пикорна- и тогавирусы) слабо поглощаются фагоцитами и могут циркулировать в крови в свободном состоянии.

3. ИНАН

Инфекционная анемия лошадей (ИНАН) naemia infectiosa eguiorum - вирусная болезнь лошадей и других непарнокопытных животных (пони, мулы, ослы и ряд других). Во время болезни у животного могут наблюдаться: лихорадка, угнетение, быстрая утомляемость, потливость, сердечная слабость, учащенное дыхание, явления геморрагического энтерита, дрожание мышц, паралич задних конечностей, также болезнь может протекать бессимптомно. РНК-содержащий вирус, относящийся к _ подсемейству Lentivirinae, семейству Retroviridae. У очищенного вируса высокая степень полиморфизма. Чаще всего вирионы сферической формы со средним диаметром 90—140 нм, имеют двух контурную оболочку. В лиофильном состоянии при 18С вирус сохраняет вирулентность в течение 1 мес. Кратковременное замораживание не действует на его активность. При 0—2С холода вирус выживает до 2 лет, в сене и на пастбище — до 9 мес., в зимне-осенний период — 8,5 мес. При биотермической обработке навоза погибает через 30 дней. В моче и навозной жиже он сохраняется до 2,5 мес., в стерильной воде — до 160 дней, в глицерине — до 7 мес. Вирус теряет свои виру­лентные свойства; при 58С через 1—2 ч, при кипячении — через 1—2 мин, под действием солнечных лучей. Помимо организма однокопытных, вирус ИНАН репродуцируется в культурах клеток из костного мозга и лейкоцитов лошади с образованием ЦПД, В других кле­точных системах накопление вируса происходит без разрушения монослоя. Пат.мат: моча, кал, носовая слизь, конъюнктив. секрет, молоко.

Восприимчивые животные, больные ИНАН, остаются вирусоносителями пожизненно. Передача возбудителя осуществляется трансмиссивным (кровососущими-слепни), ятрогенным (через раны, при проведении ветеринарных процедур), внутриутробным, половым, контактным и алиментарным путями. ИНАН не лечится; вакцин не разработано. Больные животные подлежат убою. Для человека данное заболевание не опасно. Источник возбудитель инфекции — больные восприимчивые животные. Из организма больной лошади вирус выделяется с секретами и экскретами, содержащими белок: мочой, калом, носовой слизью, молоком. Факторами передачи вируса служат корма, вода, навоз, подстилка и другие инфицированные объекты.

При сверхостром течении - подъем температуры тела, геморрагический гастроэнтерит, асфиксию, сердечную слабость, атаксию, параличи задних конечностей и гибель животных через 1-2 дня.

Острое течение болезни - лихорадкой (41…42 °С), угнетением, нарушением сердечной деятельности, исхуданием при сохраненном аппетите, отеками в области живота, конечностей, шаткостью походки, одышкой, быстрым развитием анемии. Продолжительность болезни от 3 до 15 дней, после чего животные погибают.

Подострое течение болезни длится 2…3 мес, сопровождается лихорадкой со стадиями ремиссии и такими же симптомами в период рецидива, как при остром течении.

Хроническое течение - чередованием лихорадочных периодов (через 1-3 дня) и продолжительных периодов покоя (ремиссии), наблюдается утомляемость, одышка, сердцебиение, потливость, тремор мышц, исхудание и гибель животного. Латентная форма протекает без видимых симптомов болезни.

Для серологического диагноза разработаны РСК, РДП, РИФ, РТГА.

14 Билет:

1. Прямой или неприямой метод иммунофлуоресценции.

Р.иммунофлюоресценции (РИФ) – возникает при траснформации в свет энергии поглощенной молекулами некоторых веществ (люминохромами), часть этих веществ поглощает энергию, приходят в движение, в рез-те происходит свечение. Используется люминесцентный микроскоп. Обеспечивает: визуальность, высокую чувствительность, высокую специфичность, быстрота, доступность. Используется: для выявления и титра АТ, изучение патогенеза инфекций, динамики накопления вируса в клетке, АГ-связей вируса. Методика: мазки высушивают с предполагаемым АГ, и фиксируют, а потом наносят специф. сыворотку флюоресцинирующую. Если АГ прикрепляется с АТ, те которые не связались при промытии водой смываются, в результате образуется флюоресцентный комплекс АГ+АТ, если светится, то реакция положительная, не светится – отрицательная. Прямой способ: на стекло наносят АГ, к нему добавляют АТ (флюоресц.глоублин), образуется флюоресц.комплекс АТ+АГ, при таком способе, найти можно только АГ.

Непрямой способ: АГ обрабатывают гомологичным АТ (не флюорисценц.), обр АГ+АТ комплекс, для обнаруж. которого используется флюоресценц. антивидовую сыворотку, соответствующего животного-продуцента. Антивид.сыворотка - получают, иммунизируя животных глобулином, тех видов животных, которые служат продуцентами вирусных АТ. При таком способе находят АГ и АТ.

2. Титр вируса и его определение

Титр – это кол-во вируса, содержащееся в ед. объема материала. Вирус можно титровать по инфекционному действию. Эффективность действия вируса выраражается в эффективных дозах (ЭД). В зависимости от эффекта:

ЭД50 – эффективная 50%-ая доза вируса, способная вызвать инфекционный эффект у 50% зараженных т-систем.

ЛД50 – летальная 50%-ая доза вируса, убивающая 50% лаб.животных.

ЭЛД50 – эмбриональная летальная 50%-ая доза вируса, убивающая 50% зараженных кур.эмбрионов.

ИД50 – инфекционная 50%-ая доза вируса, способная вызывать клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50% зараженных животных.

ЭИД50 – эмбриональная 50%-ая инфицирующая доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50% зараженных куринных эмбрионов.

ЦПД50 – цитопатическая 50%-ая доза вируса, способная вызвать ЦПД у 50% зараженных культур клеток.

В каждую пробирку по 9мл физ р-ра. Затем в 1 проб из бутыли с вирусом переносим 1мл вируса (пипетку в физ р-р), размешать. Затем из содержимого 1й во 2й 1мл смеси, из 2й в 3ю и тд. Из последней не выливаем. Каждым разведением мы заражаем четное число биологических систем (не менее 4х) – 4е куринных эмбриона. Ставим в термостат, затем учитываем.

Положительный эффект (+) = гибель

(1:10)++++ 2) (1:100)++++ 3) (1:1000)++-- 50% эффект =>в этом разведении содержится 1 ЭД50 = 1 ЭЛД50

4) (1:10000)---- 5) (1:100000)----

Титр вируса = числу во сколько раз надо развести исходный вирус, чтобы получить 1 ЭД50.

Если эффект не виден, то подсчёт инфекционного титра проводят по методу Рида и Менча.

Формула Кербера: lgЛД50=-lgВ – (b-50/b-a)*lgD. Где: В-разведение дающее эффект более 50%. b – процент соответствующий разведению В. а – процент соотвествующий разведению менее 50%. D – коэффициент разведения 1:10 (логарифм его равен 1).

Вирусы имеют белок-гемагглютинин. Они склеивают эритроциты. Титр определяют по эффекту гемагглютинации.

1) Готовят последовательное 2х кратное разведении вир(1:2,1:4,1:8 и т.д.)

2) В каждое разведении добавляют равный обьем 1% взвеси эритроцитов определенного вида и оставляют на контакт.

3) Учет результатов РГА в крестах:

ГА(100-75%)-«++++/+++» - полный зонтик

ГА(50%)-«++» - неполный зонтик (половина эритроцитов образуют взвесь, а другая половина осела на дно).

ГА(25%)-«+»- маленький зонтик.

ГА-«-»-пуговка (все эритроциты оседают).

2. ИНАН

Инфекционная анемия лошадей (ИНАН) naemia infectiosa eguiorum - вирусная болезнь лошадей и других непарнокопытных животных (пони, мулы, ослы и ряд других). Во время болезни у животного могут наблюдаться: лихорадка, угнетение, быстрая утомляемость, потливость, сердечная слабость, учащенное дыхание, явления геморрагического энтерита, дрожание мышц, паралич задних конечностей, также болезнь может протекать бессимптомно. РНК-содержащий вирус, относящийся к _ подсемейству Lentivirinae, семейству Retroviridae. У очищенного вируса высокая степень полиморфизма. Чаще всего вирионы сферической формы со средним диаметром 90—140 нм, имеют двух контурную оболочку. В лиофильном состоянии при 18С вирус сохраняет вирулентность в течение 1 мес. Кратковременное замораживание не действует на его активность. При 0—2С холода вирус выживает до 2 лет, в сене и на пастбище — до 9 мес., в зимне-осенний период — 8,5 мес. При биотермической обработке навоза погибает через 30 дней. В моче и навозной жиже он сохраняется до 2,5 мес., в стерильной воде — до 160 дней, в глицерине — до 7 мес. Вирус теряет свои вирулентные свойства; при 58С через 1—2 ч, при кипячении — через 1—2 мин, под действием солнечных лучей. Помимо организма однокопытных, вирус ИНАН репродуцируется в культурах клеток из костного мозга и лейкоцитов лошади с образованием ЦПД, В других кле­точных системах накопление вируса происходит без разрушения монослоя. Пат.мат: моча, кал, носовая слизь, конъюнктив. секрет, молоко. Восприимчивые животные, больные ИНАН, остаются вирусоносителями пожизненно. Передача возбудителя осуществляется трансмиссивным (кровососущими-слепни), ятрогенным (через раны, при проведении ветеринарных процедур), внутриутробным, половым, контактным и алиментарным путями. ИНАН не лечится; вакцин не разработано. Больные животные подлежат убою. Для человека данное заболевание не опасно. Источник возбудитель инфекции — больные восприимчивые животные. Из организма больной лошади вирус выделяется с секретами и экскретами, содержащими белок: мочой, калом, носовой слизью, молоком. Факторами передачи вируса служат корма, вода, навоз, подстилка и другие инфицированные объекты.

При сверхостром течении - подъем температуры тела, геморрагический гастроэнтерит, асфиксию, сердечную слабость, атаксию, параличи задних конечностей и гибель животных через 1-2 дня.

Острое течение болезни - лихорадкой (41…42 °С), угнетением, нарушением сердечной деятельности, исхуданием при сохраненном аппетите, отеками в области живота, конечностей, шаткостью походки, одышкой, быстрым развитием анемии. Продолжительность болезни от 3 до 15 дней, после чего животные погибают. Подострое течение болезни длится 2…3 мес, сопровождается лихорадкой со стадиями ремиссии и такими же симптомами в период рецидива, как при остром течении.

Хроническое течение - чередованием лихорадочных периодов (через 1-3 дня) и продолжительных периодов покоя (ремиссии), наблюдается утомляемость, одышка, сердцебиение, потливость, тремор мышц, исхудание и гибель животного. Латентная форма протекает без видимых симптомов болезни.

Для серологического диагноза разработаны РСК, РДП, РИФ, РТГА.