•Как работает: Мутация может уничтожить или создать новый сайт рестрикции. Это изменяет длину рестрикционных фрагментов, что обнаруживается при электрофорезе.
•Ограничение: Применим только в том случае, если мутация затрагивает сайт узнавания рестриктазы.
2.3. Секвенирование ДНК ("Золотой стандарт")
•Принцип: Определение точной последовательности нуклеотидов (A, T, G, C) в гене.
• Что позволяет: Выявить любую точковую мутацию (замену, делецию,
инсерцию).
•Применение:
o
o
o
Подтверждение мутаций, выявленных скрининговыми методами. Поиск новых, редких мутаций.
Прямое сканирование мутаций в небольших генах (например, ген фактора IX при гемофилии B).
•Тенденции: Развитие секвенаторов нового поколения ведет к удешевлению и увеличению производительности, что открывает перспективы для их широкого клинического применения.
3.МЕТОДЫ МУТАЦИОННОГО СКРИНИНГА
Применяются, когда характер мутации неизвестен, но есть предположение о том, в каком гене она могла произойти. Это методы предварительного поиска изменений
вгене.
•SSCP (Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК):
oПринцип: Одноцепочечные фрагменты ДНК разной последовательности имеют разную пространственную конформацию и, следовательно, разную подвижность при электрофорезе.
oЭффективность: ~80-90% для фрагментов до 200 п.н.
•HA (Гетеродуплексный анализ):
oПринцип: При анализе гетерозигот образуются гибридные молекулы ДНК (гетеродуплексы), где есть неспаренные основания. Эти молекулы
имеют меньшую электрофоретическую подвижность, чем идеально спаренные гомодуплексы.
o Комбинация SSCP + HA позволяет выявить почти 100% точковых
мутаций.
•DGGE (Денатурирующий градиентный гель-электрофорез):
o Принцип: Фрагменты ДНК разделяются в геле с градиентом
денатурирующего агента. Мутантные дуплексы "плавятся" (денaтурируют) в другой точке, чем нормальные, и останавливаются.
oЭффективность: До 95%. Часто требует использования специальных GCбогатых праймеров ("GC-зажим").
•DHPLC (Денатурирующая ВЭЖХ высокого разрешения):
oПринцип: Автоматизированный вариант гетеродуплексного анализа с детекцией на высокоэффективном жидкостном хроматографе.
oПреимущества: Высокая чувствительность и специфичность (близко к 100%), скорость анализа.
•Биочипы (ДНК-микрочипы):
oПринцип: На твердый носитель в строгом порядке нанесены тысячи ДНКзондов. Меченная флуоресцентной меткой ДНК пациента гибридизуется с чипом. Положение и интенсивность свечения указывают на наличие
специфических мутаций или полиморфизмов.
oПрименение: Массовый анализ множества мутаций, генотипирование, исследования генетической предрасположенности.
Важно: Отрицательный результат скрининговых методов не исключает наличие мутации. Окончательным подтверждением является секвенирование.
4.КОСВЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ (Анализ сцепления)
•Когда применяется: Когда ген не идентифицирован, но известна его хромосомная локализация.
•Суть метода: Прослеживание в семье не самого гена болезни, а тесно сцепленных с ним полиморфных ДНК-маркеров.
•Что такое ДНК-маркеры? Полиморфные (вариабельные) участки ДНК, расположенные рядом с искомым геном. Они наследуются вместе с ним. Виды маркеров:
1.ПДРФ (RFLP): Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов.
2.Повторяющиеся последовательности (Микросателлиты, VNTR): Наиболее информативны. Например, CA-повторы. Вариабельны по длине, высокополиморфны и равномерно распределены по геному.
•Процесс: Строится гаплотип (совокупность аллелей маркеров) для каждой хромосомы в семье. Определяется, какой гаплотип всегда наследуется с болезнью.
•Главный недостаток: Требует обследования больных родственников для установления "больного" гаплотипа. Без этого диагностика невозможна.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ И АЛГОРИТМ ДИАГНОСТИКИ (по рис. 9.21 в учебнике):
1.Поставлен клинический диагноз.
2.Выбор стратегии:
o
o
Известен ген и мутация? -> Применяются прямые методы (ПЦР, рестрикционный анализ).
Известен ген, но мутация не известна? -> Проводится мутационный
скрининг (SSCP, |
DGGE, |
DHPLC) |
с |
последующим секвенированием аномальных фрагментов. |
|
||
oГен не известен, но известна локализация? -> Применяется косвенная диагностика (анализ сцепления с ДНК-маркерами).
3.Окончательная верификация мутации.
Выбор конкретного метода зависит от оснащенности лаборатории, характера мутации и клинической задачи.