МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ (По учебнику Н.П. Бочкова "Клиническая генетика") 1. ОБЩАЯ СТРАТЕГИЯ

Молекулярно-генетическая диагностика направлена на выявление мутаций на уровне ДНК. Она делится на два принципиально разных подхода:

•Прямая диагностика: Анализ направлен непосредственно на сам мутантный ген. Применяется, когда ген известен и его молекулярная организация позволяет провести анализ.

•Косвенная диагностика (анализ сцепления): Используется, когда ген не клонирован, заболевание генетически гетерогенно или структура гена не позволяет применить прямые методы. Анализируются не сами мутации, а тесно сцепленные с геном ДНК-маркеры.

2.ПРЯМЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

Применяются для детекции известных мутаций.

2.1. Методы, основанные на ПЦР (Полимеразная Цепная Реакция)

•Суть ПЦР: Многократное копирование (амплификация) специфического участка ДНК, что позволяет работать с ничтожно малыми количествами материала.

•Аллель-специфичная ПЦР:

o Принцип: Используются праймеры (затравки), комплементарные

конкретной мутации (мутантному аллелю) или нормальной последовательности.

oКак работает: Амплификация происходит только в том случае, если праймер полностью комплементарен матрице. По наличию или отсутствию продукта амплификации судят о генотипе (нормальный, гетерозигота, мутантный).

oПример: Диагностика муковисцидоза по мутации F508. У гетерозигот амплифицируются оба аллеля (нормальный и мутантный), у гомозигот по мутации — только мутантный.

•Мультиплексная ПЦР:

oПринцип: В одной пробирке одновременно проводится несколько реакций амплификации с разными парами праймеров.

o Преимущества: Экономия времени и реагентов.

o Недостатки: Требует длительной оптимизации условий реакции.

• ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR):

o Принцип: Детекция накопления ПЦР-продукта происходит в режиме

реального времени с помощью флуоресцентных меток.

oВозможности:

1.Качественный анализ: Обнаружение специфической последовательности.

2.Количественный анализ: Определение исходного количества ДНК/РНК. Это позволяет оценивать экспрессию генов (через

анализ кДНК, синтезированной с матричной РНК).

oПреимущества: Высокая чувствительность, автоматизация, отсутствие стадии электрофореза.

oНедостатки: Высокая стоимость, требовательность к качеству матрицы.

•Метил-специфическая ПЦР:

o Принцип: Диагностика эпигенетических нарушений (изменений

метилирования ДНК). ДНК обрабатывают бисульфитом натрия, который превращает неметилированные цитозины в урацил, а метилированные остаются неизменными. Последующая ПЦР с разными праймерами позволяет отличить метилированную последовательность от неметилированной.

oПрименение: Диагностика болезней импринтинга (Прадера-Вилли, Ангельмана) и онкологических заболеваний.

2.2.Рестрикционный анализ

•Принцип: Использование бактериальных ферментов — рестриктаз, которые разрезают ДНК в строго определенных последовательностях нуклеотидов (сайтах рестрикции).