Исследование крови

Исследование этого объекта носит характер жесткого алгоритма: доказательство присутствия крови в объекте, определение видоспецифической принадлежности, установление групповых признаков и некоторых других ее характеристик, доказательство принадлежности выявленного следа крови конкретному человеку.

При исследовании следов крови могут быть решены следующие вопросы:

1. Имеется кровь на исследуемом объекте?

2. Принадлежит ли кровь животному или человеку?

3. Может ли кровь принадлежать определенному человеку (подозреваемому или потерпевшему) или принадлежность крови такому лицу исключается?

4. Принадлежит ли кровь мужчине или женщине?

5. Принадлежит ли кровь взрослому человеку или младенцу?

6. Не принадлежит ли кровь беременной женщине?

7. Из какой области тела происходит кровь в пятне? Не образовано ли пятно менструальной кровью?

8. Какова давность образования пятна?

9. Каково количество излившейся крови, образовавшей пятно?

10. Каков механизм образования следов крови?

11. Образовано ли пятно кровью живого лица или трупа?

1. Для установления наличия крови на вещественных доказательствах повсеместно используется микроспектральный метод. Сущность метода заключается в свойстве некоторых производных гемоглобина (гемохромогена, гематопорфирина) специфично поглощать определенные зоны спектра. Спектр поглощения улавливается с помощью микроспектральной насадки, смонтированной на биологическом микроскопе, на столике которого в поле зрения объектива располагается пятно. В зависимости от сохранности крови в пятне его обрабатывают либо едкой щелочью, получая спектр поглощения гемохромогена, либо концентрированной серной кислотой, получая спектр поглощения гематопорфирина. Оба метода дают специфичные результаты в разведении до 1 : 16 000. Повысить чувствительность микроспектрального исследования возможно, если облучить объект ультрафиолетовыми лучами и получить полосу возбуждения гематопорфирина в строго определенной зоне спектра. Чувствительность этой модификации 1 : 250 000.

2. Для установления видовой принадлежности крови применяется реакция преципитации. Антителами выступают специфические сыворотки к видоспецифическим белкам. Антигеном является исследуемое пятно крови. В гомологичном случае, т.е. при видовом соответствии антигена и антитела выпадает преципитат (осадок), который представляет собой комплекс антиген-антитело.

Существует целый ряд модификаций реакции преципитации: в пробирке, геле, капиллярах, на хроматографической бумаге, ацетатцеллюлозной пленке и др. Чувствительность метода особенно повышается при применении метода иммуноэлектрофореза (1 : 250 000), который позволяет дифференцировать даже таксономически близкие виды животных. Вначале проводят разделение белков на фракции с помощью электрофореза, затем добавляют преципитирующую сыворотку. В месте локализации видоспецифичных белков образуются полосы преципитации.

Качественно новые возможности определения видовой принадлежности открылись после разработки реакции иммунофлюоресценции (РИФ). Реакцию осуществляют с помощью сывороток, иммуноглобулины которых конъюгированы с флюорохромом. РИФ обладает рядом преимуществ перед другими серологическими реакциями. Она включает фазу абсорбции антигена и антитела, при этом абсорбция происходит непосредственно на поверхности клетки, что позволяет ориентироваться в расположении антигенов в исследуемом объекте. Методом РИФ можно определять видовую специфичность в минимальных следах крови.

3. Установление групповых свойств крови. Существуют многочисленные методы иммунологических, биохимических и электрофоретических исследований для изосерологической дифференциации биологических обьектов по системам АВ0, Rh, P, Льюис, Даффи, Келл, Кидд, Лютеран.

При определении группы жидкой крови по системе АВ0 используют реакцию агглютинации эритроцитов, при исследовании пятен крови — классическую реакцию абсорбции агглютининов в количественной модификации и высокочувствительные реакции абсорбции-элюции и смешанной агглютинации. Для повышения объективности метода наличие или отсутствие агглютинации выявляют под микроскопом.

За рубежом отказались от использования реакций гемагглютинации и преципитации, поскольку эти фазы иммунологических исследований неспецифичны. Перешли на радиоизотопный, в т.ч. иммунорадиометрический, и иммуноферментный анализы, в т.ч. количественный твердофазный — они более точны для установления видовой и групповой принадлежности крови и других биологиче-

ских объектов.

Для установления групповой принадлежности крови все шире применяется и реакция иммунофлюоресценции.

Из всех известных и наиболее значимых эритроцитарных антигенных систем наиболее выраженным антигенным полиморфизмом и высокой информативностью обладает система Резус (Rh). Ее антигены представляют собой гидрофобные полипептидные (без углеводного компонента) спиральные структуры, погруженные в клеточную мембрану и выполняющие функцию ионных каналов (отсутствие Rh-протеинов приводит к гемолитической анемии). В настоящее время известно более 40 Rh-антигенов.

Система Kell состоит из 23 антигенов. K-гликопротеин локализован на мембранном белке, представляющем собой Zn-связывающую металлопротеиназу

с неизвестным субстратом.

Гликопротеины гликофорина A, на которых локализованы антигены системы

MNSs, являются главными лигандами для штаммов P. Falciparum — возбудителей тяжелой тропической малярии. Структуры антигенов M и N определяют 5 концевых аминокислот гликофорина A. На гликофорине B экспрессирована другая аллельная пара антигенов этой системы — Ss.

Кроме того, антигенные свойства тканей можно различать по фенотипам многих белков сыворотки и ферментов — иммуноглобулинов, гаптоглобина, трансферрина, фосфоглюкомутазы, сывороточной холинэстеразы, алкогольдегидрогеназы и др.

Современные методы позволяют определять также антигены системы HLA.

Они наследуются кодоминантно, т.е. варианты, полученные от обоих родителей, выражены в равной мере. Поэтому на основании определения антигенов системы HLA можно также установить наличие или отсутствие кровного родства.

4. Сущность метода определения половой принадлежности сводится к установлению полового X- и Y-хроматина. Мужской Y-хроматин обнаруживается в ядрах клеток (в т.ч. и клеток крови) при окраске их акрихином или его аналогами. Женский X-хроматин устанавливают с помощью люминесцентной микроскопии.

Возможно установление половой принадлежности молекулярно-генетическим методом — путем типирования полоспецифических вариантов гена, находящегося на Х- и Y-хромосомах и кодирующего амелогенин (белок внеклеточного матрикса в зубном зачатке).

4. Установление принадлежности крови взрослому или ребенку. Метод основан на том, что младенцам свойственен фетальный тип гемоглобина HbF, взрослым — гемоглобин HbA. К моменту рождения ребенка HbF в пуповинной крови достигает 70–80%, но уже к концу первого года жизни снижается до 1–5%. Однако повышенное содержание HbF не может быть формально интерпретировано как факт однозначной принадлежности исследуемого объекта крови младенца, т.к. может наблюдаться и у беременных женщин. Дифференцируют HbF и HbA методом щелочной денатурации гемоглобина.

Частным вариантом отличия крови взрослого и младенца является ее дифференцирование: сыворотке крови матери присущ фермент лейцинаминопептидаза,

отсутствующий в крови плода.

4. Установление беременности и факта бывших родов. Для решения этого вопроса существует несколько проб: биологических и иммунологических. К первым относится реакция Ашгейма–Цондека, основанная на выявлении гормона передней доли гипофиза — пролана. Иммунологические пробы основаны на выявлении гонадотропного гормона реакцией связывания комплемента, реакцией преципитации или иммуноэлектрофореза, либо путем определения лейцинаминопептидазы, добавочная фракция которой появляется у женщин уже с 8–10 недель беременности и постепенно нарастает к ее концу, и сохраняется после родов еще около одного месяца.

5. Для установления регионального происхождения крови применяется морфологический метод, основанный на обнаружении в ней «примесей», присущих поврежденному органу, являющемуся источником кровотечения. Наиболее часто проводится дифференциация периферической и менструальной крови. Менструальная устанавливается нахождением в пятне крови клеточных элементов слизистой оболочки матки и влагалища.

6. Для определения давности образования пятен крови предложен целый ряд химических и иммунологических методов. Так, например, известно, что содержащиеся в крови ионы хлора вначале концентрируются в центре пятна, а затем постепенно мигрируют к периферии, образуя ореол, ширина которого со временем увеличивается. Другие методы основаны на разной сохранности в пятнах крови различных ферментов: лейцинаминопептидазы (до 2 месяцев), окситоциназы (около 3 мес), сывороточной холинэстеразы (до 5 месяцев) и т.д.

7. Существует соотношение между количеством сухого остатка и количеством жидкой крови, образовавшем это пятно: 1 л жидкой крови — 211 г сухой крови.

8. К механизмам образования следов крови относят ее истечение тонкой струйкой, пульсирующей струей, фонтанированием, разбрызгиванием. Кровь может истекать из ран при движении потерпевшего или при перетаскивании тела и др.

9. Факт посмертного происхождения пятна крови подтверждается обнаружением в ней ферментов, выбрасываемых посмертно в периферическую кровь (фибриногеназа). Через 1–2 ч их уровень нарастает настолько, что они могут быть выявлены в пятнах с давностью до 45 суток (метод сложен и не применим).