7. Пцр (полимеразная цепная реакция)

ПЦР является методом молекулярной биологии, который основан на многократном увеличении определенных последовательностей генетического материала при условии, что такие последовательности присутствуют в биоматериале, полученном от человека. Данный метод диагностики является быстрым и обладает высокой чувствительностью и специфичностью. ПЦР позволяет обнаружить возбудителя даже в тех случаях, когда его количество в материале минимально. Однако, как и любой другой лабораторный метод, ПЦР имеет и недостатки. Так, выявление генетического материала бактерии/вируса и других микроорганизмов не всегда указывает на присутствие возбудителя в организме на момент исследования, так как с помощью ПЦР могут быть выявлены остатки ДНК/РНК разрушенной клетки, которые не оказывают негативного влияния на организм. То есть результат будет ложноположительным. Неправильный сбор биологического материала в свою очередь может привести к ложноотрицательным результатам.

74. Ранняя диагностика инфекционных болезней. Патогномоничные симптомы инфекций, экспресс - методы лабораторной диагностики.

Раннее активное выявление инфекционных больных имеет важное значение как для их быстрейшего и полного выздоровления, а возможно и сохранения жизни при тяжелых заболеваниях, так и для эпидемического благополучия населения. необходимости обращения за медицинской помощью при появлении первых признаков заболевания, независимо от состояния и тяжести болезни. Значение диагностики как процесса распознавания болезней состоит в том, что ранний, точный, исчерпывающий и максимально конкретный диагноз является основой для проведения рациональной и эффективной терапии, позволяет в большинстве случаев предсказать возможные варианты дальнейшего течения и исходов заболевания, а в инфекционной патологии служит еще и исходным моментом в проведении своевременных и направленных противоэпидемических и профилактических мероприятий.

Диагностика инфекционных болезней базируется на всестороннем и систематическом изучении больного, которое включает сбор анамнеза (в том числе эпидемиологического), объективное динамическое обследование органов и систем, анализ результатов лабораторного и инструментального исследования больного.

Паразитологическое обследование основано на микроскопии толстой капли и мазков крови (малярии), мазков крови и костного мозга (лейшманиоз), мазков крови и пунктатов лимфатических узлов (трипаносомоз, токсоплазмоз), кала (амебиаз, балантидиаз), испражнений и дуоденального содержимого (лямблиоз).

Бактериологическое исследование включает посев материала, взятого у больного, на питательные среды, выделение чистой культуры возбудителя и его идентификацию.

Вирусологическая диагностика по сравнению с бактериологической более сложна и трудоемка, что связано с особенностями биологии вирусов, используют куриные эмбрионы.

Как бактериологические, так и вирусологические исследования могут быть полными, ускоренными и экспрессными в зависимости от конкретной ситуации.

Практически важным представляется экспрессный метод диагностики инфекционных болезней с использованием иммунофлюоресценции (метод Кунса). Иммунофлюоресцентная диагностика, основанная на специфическом свечении комплекса антиген—антитело, позволяет получить ответ через несколько минут после обработки препарата из первичного материала специфической флюоресцирующей сывороткой.

В последние годы разрабатываются и внедряются способы обнаружения антигенов возбудителей в крови, моче, слюне и других биологических средах организма, в том числе с помощью реакций коагглютинации, латекс-агглютинации, иммуноферментного анализа, моноклональных антител, что существенно расширяет возможности ранней специфической диагностики инфекций.

Для некоторых инфекций, вызываемых вирусами (герпес-вирус I и II типа, цитомегаловирус, ВИЧ, вирус гепатита В) и бактериями (энтеротоксигенные Е. coli, возбудитель гонореи, (Chlamydia trachomatis), разработаны молекулярно-биологические методы диагностики: ДНК-ДНК-гибридизации и(или) полимеразной цепной реакции (амплификации). Эта группа методов отличается исключительной, практически предельной чувствительностью, с их помощью можно обнаружить одну бактериальную клетку или вирус, если они присутствуют в материале.

К специфическим лабораторным методам диагностики, как указывалось выше, относятся и серологические исследования. В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. В сыворотке крови инфицированного или иммунизированного организма антитела находятся в глобулиновой фракции и относятся к различным классам иммуноглобулинов.

С диагностической целью серологические реакции применяют для обнаружения антител в сыворотке крови обследуемого больного, поэтому исследование проводится с заведомо известными антигенами.

При серологической диагностике бактериальных и протозойных инфекций в качестве антигенов применяют взвеси живых и убитых бактерий и простейших, экстракты или изолированные химические фракции из них.

Достоверные результаты серологической диагностики получают при изучении «парных» сывороток крови больных, взятой в первые дни болезни и через разные промежутки от начала заболевания. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания титров антител. При вирусных инфекциях лишь повышение титра антител во второй порции сыворотки в 4 раза и более имеет диагностическое значение.

Широко используется иммуноферментный анализ (ИФА), который предложен главным образом для специфической диагностики паразитарных и вирусных болезней. Высокая чувствительность и специфичность, низкая стоимость одного исследования, простота и доступность метода, объективность учета результатов реакции, и быстрота получения ответа делают ИФА одним из лучших и надежных методов серологической диагностики многих инфекций.

Диагностике ряда инфекционных болезней способствуют кожные пробы с аллергенами, полученными при соответствующей обработке культуры микроорганизма-возбудителя. Аллерген вводят внутрикожно или наносят на скарифицированную кожу. У больного, сенсибилизированного к данному виду микроорганизма, на месте введения специфического аллергена через 24—48 ч развивается воспалительная реакция (положительная проба). Примером могут служить положительные внутрикожные реакции на тулярин (туляремия), туберкулин (туберкулез), бруцеллин (бруцеллез, проба Бюрне), малеин (сап), дизентерии (дизентерия, проба Цуверкалова), токсоплазмин (токсоплазмоз).

особенную ценность при диагностике инфекционных заболеваний имеют патогномоничные симптомы - признаки, характерные только какой-то одной форме инфекционной патологии. Вот некоторые примеры таких симптомов:

- пятна Вольского-Филатова-Коплика на слизистой ротовой полости характерны только для кори;

- для коклюша характерен особый кашель - судорожный с репризами;

- опистотонус (выгибание спины) является характерным симптомом столбняка;

- водобоязнь - отличительная черта бешенства;

- менингококковую инфекцию можно со 100%-ой уверенностью диагностировать по наличию визикулезной сыпи по ходу нервных стволов.

Патогномоничные симптомы известны для большинства инфекционных заболеваний, и каждый врач-инфекционист обязан знать самые распространенные из них.

Кроме всего прочего, существует группа симптомов, которая занимает как бы промежуточное положение между общей и патогномоничной симптоматикой. Эти симптомы могут встречаться не только у инфекционных заболеваний, но и у других тоже. К примеру, увеличенные размеры печени характерны как для вирусного гепатита, так и для цирроза печени, сердечной недостаточности, малярии, брюшном тифе..., увеличенный размер селезенки встречается при брюшном тифе, сепсисе, малярии, вирусном гепатите.

Именно поэтому любые инфекционные заболевания людей диагностируются при сочетании множества признаков с применением множества методов анализа и инструментальной диагностики, потому что, повторимся, от этого зависит выбор метода лечения болезни, и, соответственно, успех от этого.

Экспресс ДИАГНОСТИКА Инфекционных Заболеваний

Методы экспресс-диагностики инфекционных заболеваний до недавнего времени развивались главным образом на основе классических схем микробиологического анализа, который сводится к выделению возбудителя в чистой культуре с последующей его идентификацией по многим характерным свойствам. Многоэтапность этих анализов обусловливает их длительность и практически исключает экспрессность, удовлетворяющую эпидемиологическую и клиническую практику. длительность микробиологического анализа составляет, как минимум, несколько дней. Серологические методы диагностики могут продолжаться от нескольких часов до 2–3 сут. Экспресс-индикация находится на переднем крае научного поиска новых методов обнаружения микробов — простых, экономичных, быстрых, благодаря чему лабораторная служба совершенствуется и эффективно используется в практике инфекционных болезней.

Основные требования, предъявляемые к экспрессным методам диагностики инфекционных заболеваний, сводятся к следующему:

— получение результатов анализа в максимально короткие сроки (в течение нескольких часов, идеально — минут);

— возможность проведения и завершения анализа без выделения искомого микроорганизма в чистой культуре, при использовании только нативного материала, в крайнем случае — с привлечением элективных биосред для быстрого накопления возбудителей;

— бесспорно высокая специфичность и высокая чувствительность как предпосылки надлежащей достоверности анализа;

— высокая производительность, простота, доступность и воспроизводимость анализов.

Наиболее желательным является параллельное применение двух-трех экспресс-методов. Такой подход значительно увеличивает надежность получаемого результата.

К экспресс-диагностике можно отнести методы микроскопии — обнаружение возбудителя в исследуемом материале (столбняк, сибирская язва, менингококковая инфекция, малярия, амебиаз и др.). Результат получают в течение 1 ч после забора материала. чаще используют серологические (иммунологические) реакции для выявления возбудителя или антигена. Например, реакция нейтрализации холерного вибриона позволяет получить положительный результат уже через 6–8 ч. Усовершенствованная реакция, основанная на использовании в качестве тест-системы иммунодиагностических холерных микропленок (иХМП), позволяет увидеть положительную реакцию (зерна агглютината, окрашенные в зеленый цвет) уже через 1–3 мин.

Современные тест-системы для экспресс- диагностики снабжены специфическими антителами к нескольким видам микроорганизмов.

Например, для экспресс-диагностики больных гнойным менингитом проводится слайд-реакция нейтрализации; используемая тест-система снабжена специфическими антителами к менингококку, пневмококку, стафилококку. Такие же многокомпонентные тест-системы используют для постановки РИФ при обследовании больных гриппом и другими ОРВи.

В то же время совершенствуются бактериологические методы, позволяющие выявить рост патогенных микроорганизмов в течение 24 ч.

Экспресс-диагностика отличается простотой и скоростью проведения исследований. Большое практическое значение имеют тест-системы экспресс-диагностики, не требующие для проведения исследования какой-либо аппаратуры и много времени. Они построены по типу тест-полосок с визуальной оценкой результата. На такую полоску достаточно нанести каплю исследуемой плазмы крови — изменение цвета полоски или появление определенного рисунка указывает на наличие в организме больного антигена возбудителя или антител к нему. Например, по такому принципу созданы тест-системы для выявления гепатита В (гепатит В гексагон), гепатита С (иХА-анти-ВгС- ФАКТОР) и др.

Эти методы исследования имеют большее зна- чение при острых инфекционных заболеваниях, однако они не всегда точно могут подтвердить наличие инфекционной патологии при хрониче- ском течении, то есть при бактерионосительстве, когда требуется использование других дополнительных метолов.