4. Подвижная фаза

Наряду с сорбентами и их активностью на разделение оказывает влияние выбор растворителя для элюирования. Элюент смывает разделяемые вещества с сорбента и переносит их дальше. Чем сильнее адсорбируется сам элюент, тем больше его вытесняющая сила. Если вещество обладает большим сродством к элюенту, чем к сорбенту, то оно элюируется ближе к фронту.

В основе хроматографического разделения лежит взаимодействие молекул компонентов разделяемой смеси с неподвижной и подвижной фазами. Элюенты, используемые в планарной, должны удовлетворять определенным требованиям:

• Высокая растворимость веществ.

• Растворитель или компоненты системы не должны быть ядовитыми или дефицитными.

• Состав подвижной фазы должен быть постоянным и легко воспроизводимым.

• Системы должна разделять вещества близкого строения.

• Индивидуальные компоненты подвижных фаз должны быть очищены.

• Подвижная фаза не должна вступать в химические реакции ни с сорбентом, ни с компонентами разделяемой смеси.

• Подвижная фаза должна быстро испаряться с поверхности хроматограммы после проведения разделения.

При выборе подвижной фазы в первом приближении рекомендуется использовать треугольник Шталя (Рисунок 3). Растворители характеризуются различной элюирующей силой (элюотропные ряды). Элюирующая сила растворителя является безразмерной величиной, зависящей только от вязкости и поверхностного натяжения растворителя.

Рисунок 3 – Треугольник Шталя

5. Способы нанесения проб

При правильно подобранной концентрации форма разделенных веществ такая же, как и форма нанесенной на линии старта. Если разделенные пятна имеют большие размеры, чем пятно на старте, то нанесенная концентрация слишком велика. Появление "хвостов", неправильная форма разделенных пятен на пластинке тоже может говорить о высокой концентрации, но может быть вызвана неправильно подобранной хроматографической системой, либо химическим взаимодействием разделяемых компонентов. Подбором количества нанесенного вещества и системы растворителей можно добиться полного разделения на одной пластинке до десяти компонентов в исследуемых веществах.

Нанесение растворов проводят либо микрошприцом, либо отградуированными капиллярами, тарфаретами, микродозаторами. Капилляр должен только касаться слоя сорбента, и проба вытекает из него под действием капиллярных сил. Растворенная проба наносится на линию старта, которая находится примерно на 1–2 см выше края пластинки. Стартовые пятна нужно делать как можно меньшего диаметра. Хроматографический слой нельзя нарушать при нанесении пробы.

Нанесение осуществляют двумя способами: в виде пятен 2 – 5 мм диаметром (1 – 2 мм на высокоэффективных пластинках) с промежутками между пятнами не менее 10 мм и в виде полос длиной 10 – 20 мм (5 – 10 мм на высокоэффективных пластинках) с промежутком между ними не менее 10 мм (Рисунок 4, а). Расстояния на стартовой линии от боковых краев пластинки до мест нанесения первой и последней проб должны составлять не менее 10 мм (Рисунок 4, б). В процессе нанесения проб недопустимо повреждение сорбента на линии старта.

(а)

(б)

Рисунок 4 – Варианты нанесения пробы на пластину (а) и схема нанесения пробы на пластины ТСХ и ВЭТСХ (б)

Нанесение пробы в форме полоски обеспечивает наилучшее разделение, которое достижимо с помощью данной хроматографической системы. Недостатком является то, что на одну пластинку можно нанести только несколько полос.

Нужно избегать нанесения пробы частями, так как при каждом дополнительном нанесении предыдущая зона будет хроматографироваться. Тем не менее, если пробу все же нужно наносить в несколько приемов, то растворитель между отдельными нанесениями следует испарять. Оптимальный наносимый объем пробы составляет для нормальных пластинок с силикагельным покрытием около 0,5 мкл (максимально до 2 мкл).

2. Практическая часть лабораторной работы

   1. Оборудование для проведения анализа

• Устройство для сушки посуды ПЭ-2000

• Шкаф лабораторный вытяжной ШВЛ-05.2 с водой

• Шкаф сушильный ШС-80-01 СПУ

• Весы электронные аналитические OHARUS PR224 19 N- камера хроматографическая для пластин 15х15 см

• Трафарет для разметки пластин 10х10 см

• Облучатель хроматографический Sorbfil (на длину волн 254 и 365 нм)

• Набор лабораторной посуды из стекла по ГОСТ 25336-82 (цилиндр мерный (10 см3 (цена деления 0,2 см3) и 100 см3 (цена деления 1,0 см3) по ГОСТ 1770,

• Эксикатор 1-140, или 1-190, или 1-250,

• Лопаточка стеклянная длиной 220 мм, диаметром 5-7 мм,

• Пеницилинки,

• Воронка лабораторная В-75 140

• Стаканы для взвешивания и пипетки с разной ценой деления)

• Пипетка Пастера 1 мл

• Чашка фарфоровая диаметром 200 мм по ГОСТ 9147

• Груша резиновая

• Дозатор автоматический Thermoscientific 1-10 мл

• Дозатор автоматический Thermoscientific 500-5000 мкл.

• Магнитная мешалка с температурой нагрева до 50 ℃

• Печь муфельная ЭКПС-1

2. Реактивы и материалы

• Пластины "Сорбфил" ПТСХ-АФ-А-УФ с нанесенным слоем оксида алюминия с флуоресцентным индикатором (254 нм) на алюминиевой подложке, размер частиц сорбента 5–17 мкм.

• Толуол, ч. д. а. по ГОСТ 14710 или ГОСТ 5789. н-гексан, хч (содержание примесей 0,001 %)

• Бумага фильтровальная ФНБ или по ГОСТ 12026

• Фильтры бумажные обеззоленные марки «синяя лента» с зольностью не более 0,00038 %

• Вода дистиллированная по ГОСТ 6709

3. Ход работы

1. Подготовка пластин для ТСХ

   1. Произвести чистку пластин для ТСХ хлороформом или используемой в ходе анализа подвижной фазой. В качестве неподвижной фазы использовать пластины со слоем силикагеля.

   2. Активировать пластину при 110 ºС в течение часа

   3. После активации хранить пластины в эксикаторе.

2. Подготовить подвижные фазы

• стадия 1 – гептан (для элюирования насыщенных соединений), расстояние прохождения – 10 см (20 °С);

• стадия 2 – гептан:толуол с соотношением по объему 95:5 (для элюирования моноароматических соединений), расстояние прохождения – 7 см (20 °С);

• стадия 3 – гептан:толуол с соотношением по объему 85:15 (для элюирования диароматических соединений), расстояние прохождения – 5 см (20 °С);

• стадия 4 – толуол (для элюирования полиароматических соединений), расстояние прохождения – 3 см (20 °С);

• стадия 5 – дихлорметан:метанол с соотношением по объему 95:5 (для элюирования полярных смол), расстояние прохождения – 1,75 см (20 °С).

3. Подготовить камеру для хроматографирования

Приготовленную подвижную фазу залить в камеру, высота слоя жидкости должна быть 1 см. Выдержать 30 мин для насыщения камеры.

4. Нанести на поверхность пластины стартовую линию на расстоянии 1,5 см.

5. Нанести на поверхность пластины те же растворы пробы, дать испариться растворителю. Размер пробы должен составлять от 0,1 до 50 мкг. На готовой к хроматографическому процессу пластинке пробы должны находиться в сухом виде.

6. Пластину с нанесенными пробами помещают в камеру, опуская ее в подвижную фазу со стороны линии старта и устанавливают в вертикальном положении, пластинки с незакрепленным слоем устанавливают под углом 15-20°. Растворитель начинает двигаться по пластинке — заметна горизонтальная полоса — фронт движения растворителя. При прохождении через точки, в которые нанесены пробы исследуемой смеси, начинают протекать процессы распределения и адсорбции, в зависимости от которых вещества смеси располагаются на разном удалении от линии старта.

7. Далее извлечь пластину, заполнить камеру второй подвижной фазой, провести насыщение камеры в течение 30 мин.

8. Провести анализ пластин с использованием УФ-света.

9. Провести процесс хроматографирования с использованием 5 подвижных фаз. После завершения процесса хроматографирования пластинку извлекают и подсушивают до полного удаления растворителя.

10. По окончании разделения хроматограмму вынимают из камеры. Детектирование провести с использованием УФ-облучателя для обнаружения веществ с использованием флуоресценции при длинах волн от 254 до 366 нм. Парафины и нафтены в слабо флуоресцируют. Ароматические соединения, начиная от бензола, обладают слегка видимой флуоресценцией (полосы поглощения видны в коротких длинах волн обыкновенного ультрафиолета), но флуоресценция увеличивается по мере усложнения структуры кольца, полосы поглощения близки к видимой области или в самой видимой области. Найдено, что спектры поглощения люминесцирующих ароматических соединений находятся в ближней УФ-и видимой области протекают до 600нм.

Рисунок 5 – Полученные хроматограммы в УФ-облучении

Парафины и нафтены в слабо флуоресцируют. Ароматические соединения, начиная от бензола, обладают слегка видимой флуоресценцией (полосы поглощения видны в коротких длинах волн обыкновенного ультрафиолета), но флуоресценция увеличивается по мере усложнения структуры кольца, полосы поглощения близки к видимой области или в самой видимой области.

На рисунке 5 видно, что спектры поглощения люминесцирующих ароматических соединений находятся в ближней УФ-и видимой области протекают до 600 нм. Цвета люминесценции меняются в следующем порядке: фиолетовый (моно-), голубовато-фиолетовый (би-), голубовато-зеленый (три-), желтый (тетра-), желто-коричневый (смола).