●​ под воздействием факторов (физических, химических) провирус может активироваться → продуктивная инфекция.

7.​Особенности биосинтеза ДНК- и РНК-содержащих вирусов.​

днк-содержащие вирусы

общая схема:​

днк → мРНК → белок

транскрипция ●​ происходит в ядре клетки (кроме поксвирусов — у них собственная

рнк-полимераза).

●​ используется клеточная РНК-полимераза II; вирус лишь предоставляет матричную днк.

репликация вирусной днк ●​ фермент: днк-полимераза (обычно клеточная, но у герпесвирусов

— собственная).

●​ создаются копии вирусного генома.​

трансляция ●​ на клеточных рибосомах, как и у обычных клеточных мРНК.

●​ синтезируются вирусные белки и ферменты.​

примеры: вирус герпеса, аденовирус, папилломавирус, поксвирус.

рнк-содержащие вирусы

у клетки нет ферментов, способных синтезировать мРНК с матрицы рнк,​

поэтому вирусы решают эту задачу по-разному

1.вирусы с позитивной (+) рнк их рнк = готовая мРНК

схема:​

+РНК → белок (в т.ч. РНК-зависимая РНК-полимераза)​ +РНК → -РНК → новые +РНК

примеры: вирус гепатита C, вирус краснухи, пикорнавирусы (полиомиелит).

2.вирусы с негативной (-) рнк

их рнк комплементарна мРНК — рибосомы не могут её читать. поэтому вирус приносит с собой фермент — РНК-зависимую РНК-полимеразу.

схема:​

-РНК → +мРНК → белки​ -РНК → +РНК → новые -РНК

примеры: вирус гриппа, парагриппа, бешенства.

3. ретровирусы (+РНК с обратной транскрипцией)

особый путь — с встраиванием в геном хозяина.

в таком состоянии вирус не разрушает клетку, а «живет» внутри неё, передаваясь дочерним клеткам при делении.

что происходит при вирогении:​

​вирусная нуклеиновая кислота (чаще ДНК, но иногда и РНК через промежуточный этап) интегрируется в хромосому клетки.​

​эта вирусная ДНК (или кДНК, если изначально вирус был РНК-содержащим, как ВИЧ) называется провирусом.​

​провирус реплицируется вместе с клеточной ДНК, не вызывая разрушения клетки, и таким образом сохраняется в потомстве.

укаких вирусов это встречается:

●​ бактериофаги (например, умеренные фаги — λ-фаг у кишечной палочки);

●​ онкогенные вирусы, способные вызывать опухоли (папилломавирус, вирус Эпштейна-Барр, ретровирусы);

●​ вирус гепатита В, ВИЧ и некоторые аденовирусы.​

у ДНК-вирусов процесс интеграции обычно прямой — вирусная ДНК просто встраивается в геном.​ ​ у РНК-вирусов (как ВИЧ) сначала происходит синтез обратной

ДНК-копии с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы).

что это даёт клетке и вирусу:

●​ вирус получает «убежище» — он не распознаётся иммунной системой и не уничтожается;

●​ клетка может получить новые свойства: например, устойчивость к

другим вирусам или, наоборот, развитие патологических изменений; ●​ иногда это приводит к опухолевой трансформации — вирусные

гены активируют клеточные онкогены или подавляют

гены-супрессоры опухолей.​

возможные последствия:​

интеграция вирусного генома может:

●​ вызывать хронические или латентные инфекции (вирус «спит» внутри клетки);

●​ привести к активации аутоиммунных процессов; ●​ стать причиной опухолевого роста;

●​ под влиянием факторов (УФ-излучение, химические вещества) провирус может активироваться — «проснуться» и начать продуктивный цикл размножения.​

отличие от продуктивной инфекции:

●​ при продуктивной вирус активно размножается, разрушая клетку; ●​ при интегративной (онкогенной) вирус не убивает клетку, а

изменяет её генетическую программу, превращая её в носителя своей информации.

в итоге вирогения — это тонкое и долгосрочное сосуществование вируса и клетки, где границы между «вирусом» и «хозяином» становятся почти незаметными.

9.​Среды для выращивания культур клеток, их классификация, требования.​

среды для клеточных культур — это питательная жидкость или полутвёрдая среда, обеспечивающая рост, размножение и поддержание жизнедеятельности клеток вне организма. они создают условия, максимально приближенные к внутренней среде организма.

1. классификация сред

а) по составу:

1.​ нативные (естественные)​

○​ содержат плазму крови, сыворотку, тканевые экстракты.

○​ преимущество: близость к физиологическим условиям.

○​ недостаток: непостоянный состав, возможна бактериальная

контаминация.​

2.​ искусственные (синтетические, определённого состава)​

○​ химически определённые компоненты (аминокислоты, сахара,

соли, витамины).

○​ преимущество: стабильность и воспроизводимость экспериментов.

○​ примеры: eagle’s minimal essential medium (mem), dulbecco’s modified eagle medium (dmem).​

б) по агрегатному состоянию:

●​ жидкие — для суспензионных культур или прикреплённых клеток.​ полутвёрдые — содержат агар или гель; применяются для

выделения клонов или вирусологических исследований.​

в) по функциональному назначению:

1.​ для первичной культуры — максимально мягкие, с сывороткой для адаптации клеток.

2.​ для поддерживающей культуры — оптимизированные по составу,

могут содержать меньше сыворотки.​

для экспрессии вирусов/вирусной репликации — иногда добавляют специфические факторы, стимулирующие вирусное

размножение.​

2. основные компоненты среды

●​ минеральные соли — поддерживают осмотический баланс и функцию мембран.

●​ углеводы (глюкоза) — источник энергии.

●​ аминокислоты — строительные блоки для белков.

●​ витамины — катализаторы метаболических процессов.

●​ сыворотка (обычно фетальная бычья, FBS) — ростовые факторы, белки, гормоны.

●​ буферы (NaHCO , HEPES) — поддержание pH.

●​ антибиотики (пенициллин, стрептомицин) — защита от бактериального загрязнения.​

3. требования к средам

1.​ поддержание жизнеспособности клеток — подходящий pH (обычно 7,2–7,4), осмотическое давление, температуру (36–37°С для млекопитающих).

2.​ стабильность компонентов — химически и биологически.

3.​ отсутствие токсичности — компоненты не должны подавлять рост клеток или вирусов.

4.​ воспроизводимость — одинаковые результаты при разных партиях сред.

5.​ свобода от контаминантов — стерильность, отсутствие вирусов,

микробов, грибов.

6.​ оптимизация для конкретного типа клеток — эпителиальные,

фибробластные, лимфоидные и др.​

10.​ Индикация вирусов в культурах клеток и тканей.​

цитопатическое действие (ЦПД)

суть: вирус вызывает дегенерацию клеток с последующей гибелью и отслаиванием от стекла.

●​ полная дегенерация: пикноз ядра и цитоплазмы, отслаивание монослоя.

●​ частичная дегенерация:

○​ гроздеобразование — клетки округляются, увеличиваются и сливаются, образуя скопления (аденовирусы);

○​ очаговая деструкция — очаги поражённых клеток на фоне

парагриппа, РС-вирус, герпеса, ВИЧ).

●​ пролиферативный тип ЦПД — клетки трансформируются в злокачественные (онкогенные вирусы).​

сроки проявления ЦПД: от 1–2 дней (полиовирус) до 7–14 дней (аденовирус). если ЦПД не выражено — проводят слепые пассажи (заражение новых культур вирусной суспензией).

цветная проба

принцип: оценивают кислотность среды, изменяющуюся при метаболизме клетки, с помощью фенолового красного:

●​ нормальная жизнедеятельность — среда оранжево-жёлтая; ●​ при вирусной инфекции — метаболизм подавлен, среда остаётся

красной.​ подходит для вирусов, вызывающих ЦПД (аденовирусы,

энтеровирусы).​

внутриклеточные включения

суть: вирусы образуют скопления в цитоплазме или ядре клеток.

●​ выявляются окраской по Романовскому-Гимзе или флюорохромами (акридиновый оранжевый)

●​ типично для вирусов оспы, герпеса, бешенства.​

прямая иммунофлюоресценция (РИФ)

принцип: выявление вирусных антигенов с помощью специфических

антител, меченых флюорохромом (например, флюоресцеином).

●​ позволяет точно определить вирус в инфицированных клетках.​

электронно-микроскопический метод (ЭММ)

применение: в основном для исследований; позволяет видеть отдельные

вирионы и их скопления в клетках.

●​ концентрация материала: ультрацентрифугирование, колоночная

хроматография, адсорбция на антителах (иммунная ЭМ).

●​ полезен для вирусов с типичной морфологией: оспа, ротавирусы, коронавирусы, ВИЧ.​

бляшкообразование

принцип: вирус разрушает клетки под агаровым слоем, формируя бляшки

— светлые пятна на фоне окрашенного монослоя.

●​ количество бляшек отражает инфекционную активность; ●​ время образования: 36–48 ч;

●​ окраска: розово-красный фон (нейтральный красный) или прозрачные бляшки (бентонит).​

вывод: выбор метода зависит от вируса и целей исследования: ●​ быстрый скрининг — ЦПД, цветная проба; ●​ точная идентификация — РИФ, ЭММ; ●​ оценка инфекционности — бляшки.