вирусология_модуль_1_сокращённая_методчика

занятие 1. вирусологическая лаборатория и техника безопасности

цель

понять назначение и устройство вирусологической лаборатории, а также изучить правила безопасности при работе с вируссодержащим материалом.

задачи лаборатории

диагностика вирусных инфекций у животных;

контроль заболеваемости в межэпизоотический период;

оценка иммунитета после болезни или вакцинации;

участие в профилактических мероприятиях против вирусных болезней.

устройство лаборатории

в лаборатории должно быть не менее 5–6 отдельных комнат:

работа с вируссодержащим материалом;

серологические реакции;

культура клеток;

термостатная;

моечная;

склад.

всё оборудовано боксами, предбоксами, бактерицидными лампами, дезковриками. поверхности должны быть легко моющимися и устойчивыми к дезсредствам. обязательно наличие бокса с ламинарным потоком воздуха.

основные требования

1.не допускать рассеивания вирусов во внешнюю среду;

2.предотвращать контаминацию посторонней микрофлорой;

3.соблюдать личную безопасность.

правила работы

спецодежда обязательна, выходить в ней из лаборатории нельзя;

весь материал считается потенциально заражённым;

распаковка — только снаружи обработанных дезсредством ёмкостей;

рабочее место покрывается марлей, смоченной 5% раствором хлорамина;

отходы замачиваются в 5% растворах хлорамина, лизола или серной кислоты.

документация лаборатории

журнал вирусологических исследований;

журнал выделенных и уничтоженных вирусов;

журнал заражённых животных;

журнал штаммов вирусов.

асептика и антисептика

асептика — предотвращает попадание вирусов и микробов в материал и организм;

антисептика — уничтожает попавшие микроорганизмы (спирт, йод, хлорамин, формалин и др.).

в помещениях ежедневно проводится влажная уборка, раз в неделю — дезинфекция.

техника безопасности

1.входить только в халате и головном уборе;

2.не класть личные вещи на стол;

3.работать по разрешению преподавателя;

4.использовать только стерильные инструменты;

5.не выливать отходы в раковину;

6.при разливе материала — немедленно сообщить преподавателю;

7.по окончании работы — сдать инструменты и обработать руки.

взятие патологического материала

примеры телец-включений:

бешенство — тельца Бабеша–Негри;

оспа птиц — тельца Боллингера;

оспа млекопитающих — тельца Гварниери;

чума плотоядных — тельца Лентца;

инфекционный ларинготрахеит — тельца Зейфреда.

РНК-вирусы образуют цитоплазматические включения, ДНК-вирусы — внутриядерные.

окрашивание мазков

методы позволяют выявить включения и их структуру.

метод Муромцева: фиксация спиртом, окраска синькой Мансона и танином.

метод Михина: фиксация и окраска краской Гимза (1:10).

метод Морозова: использование жидкости Руге, протравы и аммиачного серебра.

тельца Бабеша–Негри видны как розово-красные включения с тёмно-синими точками на фоне нейронов.

занятие 4. методы электронной микроскопии в вирусологии

цель

ознакомиться с устройством и принципом работы электронного микроскопа, а также с методикой приготовления препаратов для исследования вирусов.

принцип метода

электронная микроскопия позволяет видеть объекты размером до 0,2–0,4 нм (разрешающая способность — 2 Å).

в отличие от светового микроскопа, изображение формируется потоком электронов, а не световых волн. метод даёт возможность наблюдать все вирусы, их форму и структуру.

применение

диагностика вирусных заболеваний;

изучение морфологии вирионов;

визуализация частиц в очищенных суспензиях или тканях.

методы подготовки препаратов

1.негативное контрастирование — используется для выявления свободных вирусных частиц.

на сеточку с коллодиевой плёнкой наносят каплю вирусной суспензии;

промывают водой;

наносят 10% раствор фосфорновольфрамовой кислоты (pH 7,0) или 5% раствор уранилацетата;

лишний раствор убирают фильтровальной бумагой и препарат исследуют.

2.напыление тяжёлыми металлами — золото, палладий, уран распыляются в парообразном виде на поверхность препарата, повышая контраст.

3.ультратонкие срезы — применяются для выявления вирусов внутри клеток.

материал фиксируют (чаще 4-окисью осмия),

обезвоживают в спирте или ацетоне,

заливают в эпоксидные смолы,

режут на ультрамикротоме на срезы толщиной 50–200 Å.

материал для исследования

смывы со слизистых (нос, рот, глаза);

содержимое кишечника, оспенные корочки;

кусочки органов и тканей больных животных;

культуральные жидкости клеточных культур;

аллантоисная жидкость куриных эмбрионов.

этапы лабораторной работы

1.изучить устройство электронного микроскопа;

2.приготовить препараты на сеточках;

3.провести контрастирование и рассмотреть под микроскопом.

занятие 5. методы люминесцентной микроскопии в вирусологии

цель

изучить устройство люминесцентного микроскопа и методы приготовления препаратов для визуализации вирусов.

суть метода

явление люминесценции — свечение веществ при переходе из возбужденного состояния в нормальное.

используется ультрафиолетовое или сине-фиолетовое освещение.

прибор оснащён светофильтрами (возбуждающий и запирающий) и теплозащитными фильтрами.

основные методы

1. флуорохромирование

обработка препарата флуорохромами для усиления свечения:

применяются акридиновые и тиозиловые красители;

акридиновый оранжевый даёт разное свечение:

ДНК — зелёное,

РНК — красное или оранжевое.

приготовление препаратов:

наносят раствор флуорохрома (1:10 000), накрывают покровным стеклом, исследуют в течение 10–20 мин;

либо фиксируют мазок спиртом, обрабатывают флуорохромом и микроскопируют.

для различия вирусных и клеточных нуклеиновых кислот применяют обработку ДНК-азой или РНК-азой: после обработки клеточные кислоты перестают светиться, а вирусные сохраняют свечение.

2. метод флуоресцирующих антител (МФА, или РИФ)

принцип: антитела, меченные флуорохромом (конъюгаты), связываются со специфическими вирусными антигенами, и этот комплекс светится.

основные флуорохромы:

ФИТЦ (флуоресцеин изотиоционат) — зелёное свечение;

родамин — красное свечение.

прямой метод:

на препарат наносят конъюгат, инкубируют 20–60 мин при 37 °C;

отмывают физиологическим раствором;

исследуют под микроскопом.

непрямой метод:

препарат сначала обрабатывают обычной сывороткой с антителами;

затем добавляют антивидовую люминесцирующую сыворотку;

метод дешевле и универсальнее.

оценка результата:

(++++) яркое зелёное свечение; (+++) зелёное; (++) слабое жёлто-зелёное;

(+) очень слабое;

(–) нет свечения.

применение:

экспресс-диагностика вирусных болезней животных (оспа, грипп, бешенство, аденовирусы и др.);

исследование антигенов и антител;

изучение патогенеза и смешанных инфекций.

занятие 6–7. использование лабораторных животных в вирусологических исследованиях

цель

изучить применение лабораторных животных, методы их заражения и правила работы с ними.

требования к животным

здоровые, из благополучных хозяйств;

восприимчивые к исследуемому вирусу;

предпочтительно молодые (высокая чувствительность);

перед опытом — карантин и осмотр (температура тела, общее состояние).

наиболее часто применяются:

белые мыши, крысы, морские свинки, хомяки, хорьки.

иногда — птицы, собаки, поросята, овцы, телята и др.

цели использования

выделение и накопление вирусов;

изучение патогенеза и морфологии;

титрование вирусов;

получение вакцин и гипериммунных сывороток;

ослабление (аттенуация) вирусов.

условия содержания

отдельные помещения (здоровые и заражённые раздельно);

маркировка заражённых животных;

одинаковый материал вводят нескольким животным для надёжности.

способы заражения

зависят от тропизма вируса:

нейротропные — в мозг (интрацеребрально);

респираторные — интраназально;

дерматотропные — на кожу или внутрикожно.

основные методы:

1.подкожный;

2.внутримышечный;

3.внутрикожный;

4.внутрибрюшинный;

5.внутривенный;

6.интраназальный;

7.интрацеребральный;

8.в переднюю камеру глаза;

9.в кончик носа (при бешенстве);

10.алиментарный (через корм).

место инъекции всегда обрабатывают спиртом и йодом.

наблюдение и вскрытие

наблюдение ведут в течение 2–3 длительностей инкубационного периода;

павших животных вскрывают сразу;

вскрытие проводят стерильно, с соблюдением асептики;

берут органы с патологическими изменениями (печень, селезёнка, лимфоузлы, мозг и др.);

делают мазки-отпечатки для микроскопии;

трупы после вскрытия утилизируют (сжигание, автоклав).

техника вскрытия

мелких животных умерщвляют смещением шейных позвонков;

труп фиксируют на кювете;

вскрывают брюшную, грудную полость, череп;

материал помещают в стерильные пробирки (по две — для вирусологии и для фиксации).

практическая часть

1.заражение белых мышей различными способами (в/в, п/к, в/м, интраназально, в/б);

2.мечение заражённых животных;

3.вскрытие погибших или умерщвлённых мышей, отбор материала.

занятие 8. культивирование вирусов на куриных эмбрионах

цель