Микробиология. Лекции / Zanyatie_10_Reaktsii_3-go_pok-ya_Vaktsiny_Syvorotki_2022_v2
.pdf
Реакции гуморального иммунитета
(3-е поколение)
Вакцины
Сыворотки
Кафедра микробиологии и вирусологии ПГМУ д.м.н., профессор Ю. Н. Маслов презентация к занятию № 10
II курс лечебного факультета
IV - 2022 г.
Новые поколения серологических реакций нужны для:
–повышения чувствительности и специфичности,
–ускорения диагностики,
–снижения трудозатрат.
Таблица Сравнение чувствительности серологических методов
МЕТОД |
Чувствительность |
|
|
обнаружения |
|
|
антител, мкг N/мл |
|
|
|
|
Количественная реакция преципитации |
10 |
– 20 |
|
|
|
Кольцепреципитация |
3 |
– 5 |
|
|
|
Реакция связывания комплемента |
0,1 |
|
Реакция агглютинации |
0,1 |
– 0,2 |
|
|
|
Реакция непрямой гемагглютинации |
0,003 |
– 0,006 |
Различают 3 поколения серологических реакций:
•Реакции 1-го поколения (аналоги природных): реакция агглютинации (включая пробу Кумбса), реакция преципитации, реакция лизиса, реакция нейтрализации, реакция связывания комплемента.
•Реакции 2-го поколения (реакции с сорбированными компонентами): реакция непрямой гемагглютинации, реакция латекс-агглютинации, реакция коагглютинации.
•Реакции 3-го поколения (реакции с мечеными компонентами): иммунофлуоресцентные, иммуноферментные, иммунохроматографические и иммунохемилюминесцентные методы (можно упомянуть и радиоиммунные методы).
Вводная: в апреле 1979 г. в Чкаловском районе Свердловска (Екатеринбурга) возникла и начала набирать обороты эпидемия cибирской язвы. Власти молчали. Через несколько недель появилась «легенда» о том, что причиной гибели десятков (а по неофициальным данным – сотен) людей стала инфекция, проникшая в город вместе с мясом зараженных животных...
Однако в этом районе находилось желтое здание, обнесенное забором - Свердловск-19 (НИИ гигиены МО СССР), входивший в систему «Биопрепарат». Здесь занимались вопросами, связанными с биологическим оружием…
Что можно экстренно выявить, чтобы подтвердить диагноз ООИ?
Чистую культуру – долго; антитела – поздно, а антиген – всегда!
Первой из реакций 3-го поколения стала РИФ – Реакция ИммуноФлюоресценции
РИФ основана на присоединении к антигенам бактерий или вирусов специфических антител, меченых флюоресцирующими красителями: флуоресцеина изотиоцианат, родамин и др.
В результате бактерии или пораженные вирусом клетки ярко светятся под люминесцентным микроскопом → т.е. реакцию ставят на предметном стекле
– или на «твердой фазе»...
Этот вариант называется «прямая иммунофлюоресценция»(ПИФ) Позволяет быстро и специфично выявлять антигены возбудителя в клиническом материале.
Стал основой экспресс-диагностики инфекционных заболеваний
Продолжая пример:
РИФ как экспресс-диагностика сибирской язвы:
Постановка РИФ с ФИТЦ-мечеными иммунными сыворотками* дает возможность выявить B.anthracis в исследуемом клиническом материале
Исследование занимает около 2 час.
* - сыворотки могут содержать антитела против соматического, капсульного или спорового а/г
Какие недостатки могут быть у РИФ?!
РНИФ – Реакция Непрямой ИммуноФлюоресценции отличается:
1. многоэтапностью
2. бóльшим количеством компонентов
1 этап: образование иммунных комплексов определенного антигена со специфическими антителами.
2 этап: выявление этого комплекса путем обработки его меченой антиглобулиновой сывороткой*.
*- антиглобулиновую сыворотку называют антивидовой (как ее получают?! – «дежурный» вопрос)
РНИФ более универсальна; ее удобно использовать в обоих направлениях:
-для экспресс-выявления возбудителей (она экономнее ПИФ);
-для определения титра специфических антител в сыворотке крови больного.
Схема постановки РНИФ для определения титра специфических антител в сыворотке больного
1. Готовят |
|
|
|
|
|
|
|
|
Разведения сыворотки |
|
|||||
разведения |
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
||
1/10 |
1/20 |
1/40 |
1/80 |
1/160 |
|||
сыворотки б-го |
|
||||||
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|||
2. Наносят их на слайд-препарат с
стандартным 
корпускулярным 3. Инкубируют в термостате во влажной камере диагностикумом 4. Промывают проточной водой и высушивают
5.Наносят антиглобулиновую, меченую ФИТЦ сыворотку
6.Инкубируют в термостате во влажной камере
7.Промывают проточной водой и высушивают
8.Микроскопируют в люминесцентном микроскопе
9. Оценивают |
1/10 |
1/20 |
1/40 |
1/80 |
1/160 |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
результат |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Недостатками всех вариантов РИФ были и будут:
–Необходимость прибора учета – люминесцентного микроскопа (он дорог, капризен в обращении...)
–Слайд-препараты – ручная индивидуальная работа...
–Меченые сыворотки стоят дорого, а хранятся мало...
И тогда появился конкурент:
Иммуноферментный метод
Иммуноферментный
метод (выявление антигена в материале)
искомый антиген в исследуемом (клин.) материале
конъюгат специфических антител с пероксидазой
Субстрат: Н2О2 + хромоген
учет
результатов