6. Какие биологические принципы лежат в основе выбора метода посева? Почему для выделения чистой культуры используется посев плотные питательные среды, а не в жидкие?

7. В чем заключается принцип глубинного культивирования микроорганизмов? Какие преимущества этот метод дает в промышленной микробиологии и биотехнологии по сравнению с поверхностным ростом? При глубинном культивировании какие параметры контролируются?

8. Почему большинство патогенных бактерий являются строгими гетеротрофами? Как их метаболизм адаптирован к условиям организма хозяина, и какие компоненты питательных сред могут имитировать эти условия?

9. Принцип работы селективных и дифференциально-диагностических питательных сред. Приведите примеры дифференциально-диагностических сред и их принцип действия.

10. Почему ауксотрофия может быть как признаком патогенности, так и ослабленности штамма? Как используются ауксотрофные вакцинные штаммы (например, в живых вакцинах)?

11. Какие факторы могут повлиять на качество посева (толщина штриха, влажность среды, температура инкубации)? Какие ошибки чаще всего допускают?

12. Как метод посева в столбик агара помогает определить потребность бактерий в кислороде? Опишите зоны роста характерные для аэробов, анаэробов и факультативных анаэробов.

На плотную питательную среду (агар) делают укол бактериальной петлей по центру пробирки от поверхности до почти самого дна. При последующем孵обации кислород диффундирует в среду сверху вниз, создавая градиент концентрации кислорода:

Верхние слои агара (у поверхности) — богаты кислородом (высокое парциальное давление O₂).

Нижние слои агара (у дна пробирки) — бедны кислородом (низкое парциальное давление O₂, условия, близкие к анаэробным).

Таким образом, одна пробирка создает для бактерий весь спектр условий — от аэробных до анаэробных. Бактерии будут расти только в тех зонах, где концентрация кислорода соответствует их метаболическим возможностям.

. Облигатные (строгие) аэробы

У поверхности. Рост наблюдается только в верхней части столбика, в виде плотной полосы или "шапочки".

2. Облигатные (строгие) анаэробы

У дна. Рост наблюдается в нижней части столбика, вдали от поверхности.

3. Факультативные анаэробы

По всему столбику, но с наибольшей интенсивностью у поверхности. У поверхности, где много кислорода, их рост самый густой, так как аэробное дыхание дает больше энергии. По мере углубления рост становится менее интенсивным, но все же заметным.

4. Аэротолерантные анаэробы

Равномерно по всему столбику. Рост равномерный от верха до низа, без выраженного усиления у поверхности, так как они не получают преимущества от наличия кислорода.

5. Микроаэрофилы

В виде узкой полосы в средней части столбика. Именно там концентрация кислорода для них оптимальна — ниже, чем на поверхности, но выше, чем на дне.

13. Структурная организация клеточной стенки прокариотических клеток: химический состав, функциональное значение и связь с тинкториальными свойствами бактерий.

14. Каково биологическое значение подвижности бактерий? Какие структуры отвечают за подвижность, и как их можно различить микроскопически (в живых и фиксированных препаратах)?

15. Объясните физико-химические механизмы каждого этапа окраски по Граму. Почему грамотрицательные бактерии теряют комплекс кристаллический фиолетовый–йод при обработке спиртом, а грамположительные — нет?

А) На фиксированный мазок кладут сухую полоску фильтровальной бумаги, пропитанной карболово-спиртовым раствором генцианового фиолетового (по Синеву), наносят на нее 2–3 капли воды и выдерживают 1–2 мин.

Б) Бумагу снимают пинцетом и, не промывая водой, наносят на мазок раствор Люголя на 1 мин; мазок при этом чернеет.

В) Сливают раствор йода, обесцвечивают 95% этиловым спиртом, наливая его 2–3 раза или погружая стекло в стаканчик со спиртом в течение 30–40 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

Г) Тщательно промывают мазок водой для удаления спирта.

Наносят на мазок водный раствор фуксина на 1–2 мин.

Сливают краску, промывают мазок водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Д Грамположительные бактерии окрашиваются основным красителем в темно-фиолетовый цвет в начале окраски, грамотрицательные — контрастным красителем в красный цвет на последнем этапе окрашивания

В основе дифференциации бактерий лежит строение клеточной стенки грамположительных (толстостенных) и грамотрицательных (тонкостенных) бактерий, вследствие чего они неодинаково воспринимают красители при окраске по методу Грама.

Причина: наличие многослойного пептидогликана, наличием тейхоевых и липотейхоевых кислот (которые отсутствуют у грамотрицательных бактерий) и особенностями структурной организации клеточной стенки, поры в которой сужаются при обработке спиртом, задерживая краску. В связи с тем что грамотрицательные бактерии имеют один слой пептидогликана и большое количество липидов в составе их клеточной стенки, она имеет более высокую проницаемость и при обесцвечивании спиртом комплекс «генциановый фиолетовый–йод» легко удаляется через поры клеточной стенки, в результате чего грамотрицательные бактерии приобретают цвет контрастного (дополнительного) красителя — водного фуксина.

Подавляющее большинство бактерий хорошо окрашиваются по методу Грама, поэтому его считают основным в микробиологии. Исключение составляют спирохеты, плохо воспринимающие анилиновые красители, внутриклеточные паразиты (риккетсии и хламидии), а также бактерии, не имеющие клеточной стенки (микоплазмы и L-формы бактерий). Микобактерии в связи с особенностями строения их клеточной стенки обычно окрашивают по методу Циля–Нильсена.

16. Какие ошибки при окраске по Граму могут привести к ложной интерпретации Грам-принадлежности? Приведите примеры артефактов, связанных с недостаточной или чрезмерной деколоризацией, и объясните, как их избежать.

Недостаточная деколоризация происходит, когда спирт-деколоризатор действует слишком короткое время или его концентрация недостаточна. В результате первичный комплекс "кристаллический фиолетовый - йод" не вымывается из грамотрицательных бактерий.

Результат: Ложноположительный результат (False Gram-positive). Грамотрицательные бактерии (которые должны быть розовыми/красными) остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет и интерпретируются как грамположительные.

Решение: производить деколоризацию строго определенное время (15-30 секунд), использовать контрольные штаммы, промывать тщательно

Избыточная деколоризация - происходит, когда спирт воздействует слишком долго. Он разрушает липидный слой грамположительных бактерий и вымывает комплекс "кристаллический фиолетовый - йод" из них.

Результат: Ложноотрицательный результат (False Gram-negative). Грамположительные бактерии (которые должны быть сине-фиолетовыми) теряют цвет и при докрашивании фуксином становятся розовыми/красными, интерпретируясь как грамотрицательные.

Дополнительние ошибки:

Использование старых культур (хуже удерживают комплекс)

Смывание комплекса водой

Слишком толстый мазок культуры