2 Материалы и методы исследования

2.1 Обзор существующих методов разделения продуктов амплификации

Точность анализа ДНК зависит от многих факторов качества выделенной ДНК, условий проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также метода детекции фрагментов ДНК, полученных в результате амплификации. При благоприятном сочетании первых двух факторов выбор метода детекции ПЦР-продуктов может являться решающим в идентификации сортов (Кутлунина Н. А. Молекулярно-генетические методы в исследовании растений: учеб.-метод. пособие / Изд-во Урал. ун-та. Екатеринбург. 2017. С. 172).

В большинстве случаев детекцию результатов амплификации проводят методом гель-электрофореза. В геле отрицательно заряженные молекулы ДНК движутся от отрицательного электрода к положительному. Отличающиеся по длине фрагменты ДНК движутся с разной скоростью короткие фрагменты мигрируют быстрее длинных. Их размер определяют относительно стандарта молекулярного веса (Полиданов М.А., Блохин И.С., Скороход А.А. Методика электрофореза в агарозном геле / Modern Science. 2020. № 3. С. 69–72).

На электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов также влияет тип и концентрация геля, электрофорезного буфера, напряжение электрического поля, сила тока и другие факторы. Гели имеют свойство молекулярного сита и, изменяя их концентрацию, можно задать определенный размер пор. К примеру, ПААГ можно проводить как нативный электрофорез (для не подвергнутых денатурации фрагментов), так и электрофорез в денатурирующих условиях (за счет наличия хаотропных агентов, обычно мочевины). Разделение ПЦР-продуктов методом нативного электрофореза зависит не только от длины фрагмента, но и от пространственной структуры нуклеиновой кислоты. Электрофорез в денатурирующих условиях разделяет ДНК только по молекулярной массе, поскольку в денатурированном состоянии молекула ДНК имеет одноцепочечную структуру (Кутлунина Н. А. Молекулярно-генетические методы в исследовании растений: учеб.-метод. пособие / Изд-во Урал. ун-та. Екатеринбург. 2017. С. 172).

Электрофорез в геле позволяет легко, без применения радиоизотопов, обнаружить амплифицированную ДНК и определить ее размер. Остановимся на некоторых ее особенностях применительно к анализу ПЦР- амплифицированной ДНК.

Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом. Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламидные гели. Его проводят в специальной камере для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного. Кроме того, акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в рутинной работе используют метод горизонтального электрофореза (Давыдова, О. К. Полимеразная цепная реакция: методическое указание к лабораторному практикуму по генной инженерии / Оренбург: ИПК ГОУ ОГУ. 2009. С. 48).