МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования

«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

(ФГБОУ ВО «КубГУ»)

Факультет биологический

Кафедра генетики, микробиологии и биохимии

КУРСОВАЯ РАБОТА

МЕТОД КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ РАСТИТЕЬНОЙ ДНК

Работу выполнила

^{(подпись)}

Направление подготовки 06.03.01 Биология Курс 3 .

^{(код, наименование)}

Направленность (профиль) Биохимия .

Научный руководитель

канд. биол. наук

^{(подпись)}

Нормоконтролёр

канд. биол. наук

^{(подпись)}

Краснодар

202

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 3

1 Аналитический обзор 4

1.1 Принципы работы метода 4

1.2 Устройство капиллярного электрофореза 8

1.3 Преимущества и ограничения метода 10

2 Материалы и методы исследования 13

2.1 Обзор существующих методов разделения продуктов амплификации 13

2.2 Применение метода 14

2.3 Примеры исследований 15

2.4 Оборудование и реагенты 19

2.5 Подготовка образцов и проведение анализа 20

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 23

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ 25

Введение

В современном мире метод капиллярного электрофореза является одним из наиболее эффективных инструментов анализа биомолекул и разделения их компонентов. В сельском хозяйстве и научных исследованиях широко применяется амплификация ДНК растений для выявления генетических особенностей, генотипирования сортов или определения наличия генетически модифицированных организмов.

Применение метода капиллярного электрофореза для разделения продуктов амплификации растительной ДНК представляет актуальную тему и имеет большую практическую значимость, так как позволяет проводить быстрый и точный анализ молекулярных маркеров растений. Этот метод обеспечивает высокую разрешающую способность, чувствительность и воспроизводимость результатов, что делает его актуальным для исследований в области селекции, сельского хозяйства, биотехнологии и генетики.

Целью настоящей курсовой работы является изучение метода капиллярного электрофореза для разделения продуктов амплификации растительной ДНК и определение его эффективности и применимости в практических исследованиях. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

• Изучение принципов метода капиллярного электрофореза и его применение в анализе ДНК

• Рассмотреть основные методики выполнения капиллярного электрофореза для разделения продуктов амплификации ДНК

• Оценка эффективности и сложности метода капиллярного электрофореза для анализа растительной ДНК

Данная работа имеет теоретическую и практическую значимость, так как ее результаты могут быть использованы для улучшения методов анализа растительной ДНК и оптимизации процессов селекции и генетической модификации растений.

1 Аналитический обзор

1.1 Принципы работы метода

Электрофорез как метод разделения ионных аналитов предложен в 30-х гг. ХХ в. профессором университета в Упсале шведским биохимиком Арие Тизелиусом, разделившим белки сыворотки крови (з. Ви у-глобулины) в буферном растворе при наложении электрического поля. В конце ХХ в. благодаря в первую очередь работам Хиртена, Йоргенсона, Лукаса и Терабе был разработан новый аналитический метод капиллярный электрофорез (КЭ) (Карцова Л. А. Биомедицинские приложения метода капиллярного электрофореза // Успехи химии. 2015. Т. 84, №8. С. 860-874).

В основе капиллярного электрофореза (КЭ) лежат электрокинетические явления – электромиграция ионов и других заряженных частиц и электроосмос. Эти явления возникают в растворах при помещении их в электрическое поле, преимущественно, высокого напряжения. Если раствор находится в тонком капилляре, например, в кварцевом, то электрическое поле, наложенное вдоль капилляра, вызывает в нем движение заряженных частиц и пассивный поток жидкости, в результате чего проба разделяется на индивидуальные компоненты, так как параметры электромиграции специфичны для каждого сорта заряженных частиц. В то же время, такие возмущающие факторы, как диффузионные, сорбционные, конвекционные, гравитационные и т. п., в капилляре существенно ослаблены, благодаря чему достигаются рекордные эффективности разделений (Комарова Н. В. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза «КАПЕЛЬ» // СПб.: ООО «Веда». 2006. С. 10).

Метод КЭ основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора (2 нл) вводят в кварцевый капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером – электролитом. После подачи высокого напряжения (до 30 кВ) к концам капилляра компоненты смеси начинают двигаться с разной скоростью, зависящей, в первую очередь, от заряда и массы (точнее, величины ионного радиуса) и, соответственно, в разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков называется электрофореграммой; качественной характеристикой вещества является время миграции, а количественной – высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества (Станкевич С.В. Использование капиллярного метода электрофореза // Пища. Экология. Качество. 2020. Т. 17. С. 617-618).

Для того чтобы получить более подробное представление о методе, необходимо рассмотреть ряд процессов, происходящих в капилляре, заполненном электролитом и помещенном в продольное электрическое поле (Станкевич С.В. Использование капиллярного метода электрофореза // Пища. Экология. Качество. 2020. Т. 17. С. 617-618).

Находящиеся на поверхности плавленного кварца силоксановые группы при контакте с водой или водными растворами гидролизуются с образованием удвоенного количества силанольных групп, которые затем гидратируются (Комарова Н. В. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза «КАПЕЛЬ» // СПб.: ООО «Веда». 2006. С. 10).

Скорость и степень гидролиза зависят от температуры и рН водных растворов и, в меньшей степени, от концентрации солевого фона раствора. В водном растворе силанольные группы способны к кислотной диссоциации. Константа первой ступени имеет величину 2,5^10-3. Это означает, что при рН водного раствора больше 2,5 поверхность кварца приобретает некоторый отрицательный заряд, который возрастает при увеличении рН раствора. Наоборот, при рН 2 и меньше диссоциация силанольных групп практически полностью подавлена, и поверхность кварца становится нейтральной (Карцовой Л.А. Проблемы аналитической химии: Капиллярный электрофорез// М.: «Наука». 2014. Т. 18. С. 444)

Диссоциация силанольных групп вызывает на границе раздела кварц–водный раствор электролита образование двойного электрического слоя (ДЭС). Первую его обкладку составляют неподвижные отрицательно заряженные силанольные группы. Вторую обкладку двойного слоя составляют положительно заряженные катионы, существующие в растворе. Диэлектриком, разделяющим обкладки этого конденсатора, являются молекулы воды, гидратирующие как силанольные группы, так и катионы.

Процессы, происходящие в капилляре, заполненном электролитом и

помещённом в электрическое поле:

1. Силоксaновые группы, находящиеся на поверхности капилляра, под действием водных растворов гидролизуются, с образoванием силaнольных групп, а затем гидрaтируются (рисунок 1);

Рисунок 1 – Гидрaтация силaнольных групп

2. Скорость и степень гидролиза зависят от температуры и рН водных растворов. При рН больше 2,5 поверхность кварца имеет отрицательный заряд; при рН около 2 и меньше силaнольные группы практически не диссоциируют – поверхность кварца нейтральна;

3. На границе раздела кварц/водный раствор электролита образуется двойной электрический слой (рисунок 2) (Ламоткин С.А. Хроматография и электрофорез 2014 – С. 289).

Рисунок 2 – Строение двойного электрического слоя (ДЭС)

В результате в диффузной части ДЭС образуется некоторая избыточная концентрация катионов. Между этими двумя слоями проходит так называемая граница скольжения – при наложении вдоль капилляра электрического поля неподвижная часть остается на месте, в то время как диффузная часть начинает мигрировать к катоду, увлекая за собой в силу межмолекулярного сцепления всю массу жидкости в капилляре. Возникает электроосмотический поток (ЭОП), который осуществляет пассивный перенос раствора внутри капилляра (Станкевич С.В. Использование капиллярного метода электрофореза // Пища. Экология. Качество. 2020. Т. 17. С. 617-618).

Скорость ЭОП в сильной степени зависит от рН раствора: в сильнокислых растворах ЭОП отсутствует, в слабокислых – его скорость незначительна, а при переходе в нейтральную и щелочную область рН скорость ЭОП возрастает до максимально возможной. С другой стороны, эта величина зависит от концентрации электролита в ведущем буфере: чем она больше, тем выше становится доля катионов в неподвижной части ДЭС, а толщина диффузной части уменьшается и, соответственно, уменьшается скорость электроосмотического потока (Станкевич С.В. Использование капиллярного метода электрофореза // Пища. Экология. Качество. 2020. Т. 17. С. 617-618).

Общий потенциал, создаваемый диссоциированными силанольными группами, пропорционален заряду. Часть этого потенциала (Δψ) нейтрализуется положительными зарядами ионов неподвижной части второй обкладки двойного слоя. Остальная часть положительных зарядов создает в приповерхностном слое раствора электрокинетический потенциал (дзета-потенциал) (Станкевич С.В. Использование капиллярного метода электрофореза // Пища. Экология. Качество. 2020. Т. 17. С. 617-618).