mikrobiologia_laba_11

Микробиология, лаба 11

1. В чём заключается сущность процесса нитрификации?

Нитрификация — микробиологический процесс окисления NH3 до HNO2 или HNO2 до HNO3, что связано либо с получением энергии (хемосинтез, автотрофная нитрификация), либо с защитой от активных форм кислорода, образующихся при разложении пероксида водорода (гетеротрофная нитрификация). Процесс представляет собой двухступенчатое преобразование аммония (NH4+) в нитрат (NO3-) почвенными бактериями.

2. Кем впервые выделены чистые культуры нитрификаторов?

С.Н. Виноградский выделил чистые культуры нитрификаторов, используя селективную среду, содержащую только минеральные компоненты (чтобы избежать роста на ней банальных гетеротрофов) и в том числе сульфат

аммония.

3. Перечислите условия, необходимые для культивирования нитрификаторов.

Большинство их являются облигатными автотрофами, которые при наличии органических веществ не размножаются. Оптимальная температура для нитрификации находится в диапазоне от 25 до 30 °C в зависимости от конкретных условий. Нитрификация оптимально происходит при рН 6,5-8,5; при рН ниже 6,5 интенсивность нитрификации уменьшается, и она останавливается ниже 5. В кислой среде процесс не идет.

Нитрификаторы выращивали на средах Виноградского для I и II стадий нитрификации соответственно.

Состав среды для I стадии (г/л водопроводной воды): (NH4)2SO4—2.0; K2HPO4 – 1.0; MgSO4 ∙ 7H2O – 0.5; NaCl – 2.0; FeSO4 ∙ 7H2O – 0.05; CaCO3 – 5.0.

Состав среды для II фазы (г/л водопроводной воды): NaNO2 – 1.0, K2HPO4 – 0.5; MgSO4 ∙ 7H2O – 0.5; NaCl – 0.5; FeSO4 ∙ 7H2O – 0.4; Na2CO3

–1.0.

4.Принципы конструирования питательных сред для нитрификаторов.

Нитрифицирующие бактерии культивируют на простых минеральных средах, содержащих аммиак или нитриты (окисляемые субстраты) и диоксид углерода

(основной источник углерода). Источником азота для этих организмов служат аммиак, гидроксиламин и нитриты.

(Питательную среду наливают в плоскодонные колбы Виноградского или Эрленмейера, заражают 0,1 г почвы, плотно закрывают ватными пробками, подписывают и помещают в термостат при температуре 25–30ºС.

Элективные условия для нитрификации:

1)присутствие в среде аммиачной формы азота;

2)отсутствие в среде органических форм углерода, так как нитрифицирующие бактерии строгие автотрофы;

3)аэробные условия за счёт тонкого слоя среды на большой поверхности дна колбы;

4)нейтральная среда за счёт внесения мела;

5)набор минеральных элементов питания.

5.К какой группе по способу получения энергии относятся нитрифицирующие бактерии?

По способу получения энергии нитрифицирующие бактерии являются хемолитоавтотрофами

6. Назовите стадии процесса нитрификации.

Первая стадия — окисление аммиака до нитрит-аниона. Сначала нитритные бактерии окисляют NH3 до нитрита(NO2-).

Представитель Nitrosomonas Winogradsky.

Вторая стадия — окисление аниона азотистой кислоты до аниона азотной. Во второй стадии нитратные бактерии окисляют нитрит до нитрата. Представитель Nitrobacter Winogradsky.

7. Какие микроорганизмы осуществляют I-ю стадию процесса нитрификации?,

Осуществляют нитрозные бактерии родов Nitrosomonas, Nitrosococcus и

Nitrosospira, Nitrosolobus u Nitrosovibrio

8. Каковы основные морфологические и культуральные особенности бактерий, осуществляющих І-ю фазу

нитрификации?

Производится нитратными бактериями (почвенный род Nitrobacter и

водные Nitrospira, Nitrococcus, Nitrospina)

Наиболее детально к настоящему времени изучен Nitrosomonas europaea. Он представляет собой короткие овальные палочки размером 0,8-1 х 1-2 мкм. В жидкой культуре клетки Nitrosomonas проходят ряд стадий развития. Две основные из них представлены подвижной формой и неподвижными зооглеями. Подвижная форма обладает субполярным жгутиком или пучком жгутиков. (Культуральные свойства: Богаты цитохромами, которые придают клеточным взвесям окраску от желтоватой до красноватой; других пигментов нет.—хер знает)

9. Какие микроорганизмы осуществляют II-ю стадию нитрификации?

Вторую фазу нитрификации осуществляют представители родов Nitrobacter, Nitrospira и Nitrococcus.

10. Каковы основные морфологические и культуральные

свойства бактерий, осуществляющих II–ю стадию

нитрификации?

Наибольшее число исследований проведено с Nitrobacter winogradskyi, однако описаны и другие виды (например, Nitrobacter agilis). Клетки нитробактера имеют удлиненную, клиновидную или грушевидную форму, более узкий конец часто загнут в клювик, размеры клеток — 0,6-0,8 х 1-2 мкм. При почковании дочерняя клетка обычно подвижна, так как имеет один полярный жгутик. Известно чередование в цикле развития подвижной и неподвижной стадий. Культуральные свойства тоже хер знает

11. Какова морфология нитрификаторов?

Род Nitrosomonas.

Клетки эллипсоидальные или короткие палочки, подвижные или неподвижные, одиночные, в парах или коротких цепочках. Грамотрицательные.

Род Nitrosococcus.

Клетки от сферических до эллипсоидных. Подвижные или неподвижные. Клеточная стенка типичная для грамотрицательных бактерий, но у морских видов обнаружен дополнительный наружный слой клеточной стенки. Одиночные, в парах или в тетрадах,

Род Nitrosospira.

Клетки в виде туго скрученных спиралей шириной 0,3-0,4 мкм, с 3-20 витками. Грамотрицательные. Неподвижные или движутся с помощью перитрихальных жгутиков

Род Nitrosolobus.

Клетки плеоморфные и лопастные, 1,0-1,5 мкм в поперечнике; делятся перетяжкой. Грамотрицательные. Подвижные, движутся с помощью перитрихальных жгутиков.

Род Nitrosovibrio.

Изогнутые тонкие палочки. В начале стационарной фазы роста наблюдаются сферические формы. Подвижные клетки обладают 1-4 жгутиками

12. Как определить наличие в среде аммиака?

Выделение аммиака можно обнаружить по запаху и посинению красной лакмусовой бумажки. Накопление аммиака в среде проверяют реактивом Несслера — в лунку фарфорового плато к нескольким каплям жидкости из пробирки добавляют каплю реактива, и если аммиак есть, то жидкость станет жёлтой, а если его много – появится коричневый осадок.

13. Каким образом определить наличие в среде нитритов?

Метод Грисса основан на получении диазосоединений, которые в результате реакции окрашивают раствор в красный цвет.

Для определения нитритов в органических объектах по методу Грисса исследуют их водные вытяжки. Сначала биологический материал настаивают в воде, потом раствор фильтруют, удаляя взвешенные частицы. В конце раствор пропускают через фильтр. Полученную вытяжку подвергают воздействию реактива Грисса. Если в вытяжке присутствуют нитриты, то образуется азокраситель красного цвета. Чем окраска раствора интенсивнее, тем больше в нем нитритов.

14. Как определить наличие в среде нитратов?

Хорошие результаты даёт фотометрический метод с применением химического реагента — салицилата натрия. Фотоколориметрический метод анализа основан на измерении интенсивности светового потока, прошедшего через окрашенный раствор

К 10 мл исследуемого раствора прилить 10–15 капель щелочи, добавить 25–50 мг цинковой пыли, полученную смесь нагреть. Нитраты восстанавливаются до аммиака, который обнаруживается по покраснению фенолфталеиновой бумаги, смоченной в дистиллированной воде и внесенной в пары исследуемого раствора.

15. Ранжируйте все перечисленные соединения азота

по степени токсичности для рыб.

Аммоний, первая ступень органического разложения, не очень опасен и, как правило, быстро распадается. Он представляет опасность, если значение рН больше 8 при высокой концентрации аммония. Тогда из

безопасного аммония NH4 получается очень опасный аммиак NH3.

Специфическая токсичность аммиака для рыб изучена недостаточно, но полагают, что он снижает способность гемоглобина связать кислород.

В воде рыбоводных прудов — наличие нитритов также нежелательно. В воде летних карповых прудов допустимо содержание их от сотых до десятых долей мг/л, а в зимовальных прудах — тысячных долей. Большее

количество нитритов в воде приводит к ослаблению резистентности(устойчивости) рыб и даже к их гибели.

Нитрат N03 переносится рыбами даже в сравнительно высокой концентрации. Это последняя ступень разложения. Чувствительны к нитратам прежде всего личинки и рыбная молодь, поэтому в выростных аквариумах нужно особенно часто менять воду. Увеличение содержания их, особенно органического происхождения, отрицательно сказывается на состоянии рыб — понижается резистентность(устойчивость) организма.

16. Какие гетеротрофные микроорганизмы способны к нитрификации?

Способны осуществлять нитрификацию и некоторые гетеротрофные микроорганизмы. К ним относятся бактерии из родов Pseudomonas,

Arthrobacter, Corynebacterium, Nocardia и отдельные виды грибов из родов

Fusarium, Aspergillus, Penicillium, Cladosporium