микробиология лаба 10

Микробиология, лаба № 10

1. В чем заключается сущность процесса азотфиксации?

Азотфиксация, процесс связывания молекулярного азота (N2) атмосферы и перевода его в азотистые соединения. Азотфиксация осуществляется при участии ферментного комплекса – нитрогеназы Процесс азотфиксации достаточно энергоёмкий, для ассимиляции 1

молекулы азота требуется не менее 12 молекул АТФ, то есть для использования 1 мг азота анаэробным микроорганизмам требуется около 500 мг сахарозы.

2. Какие микроорганизмы могут усваивать атмосферный азот?

Способность к азотфиксации выявлена у большинства прокариот – бактерий и архей, относящихся к разным физиологическим и таксономическим группам. Эукариоты не способны к азотфиксации.

Клубеньковые бактерии рода Rhizobium, а так же бактерии рода

Bradyrhizobium, Pseudomonas, цианобактерии (Synechococcus, Prochlorococcus, Anabaena, Spirulina и т.д.)

3. Что такое свободноживущие и симбиотические азотфиксаторы?

Свободноживущие азотфиксаторы — микроорганизмы, обитающие в почве самостоятельно и способные использовать атмосферный азот.

(Azotobacter, Clostridium)

Симбиотические азотфиксаторы — усваивают молекулярный азот,

только находясь в симбиозе с растением (Bradyrhizobium ,Rhizobium)

4. Каких основных представителей аэробных азотфиксаторов вы знаете?

Бактерии рода Azotobacter(Azotobacter chroococcum, Azotobacter vinelandii), Azomonas, Beijerinckia, Derxia

5. В чем заключаются принципы составления питательных сред для выделения свободноживущих азотфиксаторов?

Представители рода Azotobacter способны использовать углеводы (например маннит, сахарозу, глюкозу), спирты (в том числе этанол и бутанол) и соли органических кислот, в том числе и бензоаты, в качестве источника углерода и энергии. Представители рода растут на безазотистых средах, предназначенных для выделения свободноживущих азотфиксирующих и олигонитрофильных организмов, например на среде Эшби, содержащей источник углерода (маннит, сахароза или глюкоза) и необходимые микроэлементы (источник фосфора, серы и т. д.), или на среде М. В. Фёдорова, содержащей больше микроэлементов, также на жидкой среде Бейеринка.

Накопительная культура свободноживущих азотфиксаторов ставится с использованием жидкой питательной среды, не содержащей солей азота (среда Эшби), следующего состава: глюкоза – 2,0% , КН2РО4 – 0,2% MgSO4 – 0,2% , NaCl – 0,2% , K2SO4 – 0,1% , FeSO4 – 2 капли 1% раствора

6. Какие микроорганизмы фиксируют азот в симбиозе?

Азотфиксирующие микроорганизмы, которые живут в симбиозе с корнями бобовых растений и образуют на их корнях клубеньки, называют клубеньковыми

бактериями.

Бактерии рода Rhizobium в симбиозе с бобовыми культурами способны фиксировать свободный азот атмосферы, превращая его в соединения, легкоусвояемые растением. Эти бактерии являются строгими аэробами. Среди бактерий рода Rhizobium различают активные, малоактивные и неактивные культуры

Клубеньковые бактерии относятся к роду Rhizobium . Форма и величина клубеньковых бактерий изменяется в зависимости от стадии их развития. В молодой культуре они представлены короткими подвижными палочками, со временем они утрачивают подвижность и переходят в стадию так называемых опоясанных палочек. При окраске анилиновыми красителями ярко окрашенные участки цитоплазмы чередуются со светлыми полями, в которых концентрируются жировые включения, не воспринимающие окраску. При старении культуры опоясанные палочки переходят в стадию бактероидов, клетки ветвятся принимая причудливую форму кораллов. Стадии опоясанных палочек и бактероидов обычно совпадают с фазой бутонизации и цветения бобовых растений и характеризуются максимальной интенсивностью фиксации азота.

7. Что такое бактероиды, леггемоглобин?

Бактеро́иды — особая покоящаяся форма, имеющаяся у бактерий порядка

Rhizobiales. Бактероиды образуются в корневых клубеньках растений семейства Бобовые (Fabaceae). Они представляют собой крупные (в 10—40 раз крупнее обычных) клетки неправильной формы, нередко разветвлённые. В клубеньках, содержащих бактероиды, имеется пигмент легоглобин, близкий к гемоглобину.

Легоглоби́н (леггемоглобин) — железосодержащий белок красного цвета, разновидность гемоглобина, содержащаяся в клубеньках бобовых растений и придающая им красный цвет, он связывается с О2 и регулирует его содержание в цитоплазме бактероидов, защищая тем самым нитрогеназу от ингибирующего действия кислорода.

Также как и клубеньковые бактерии, Bradyrhizobium образуют клубеньки, в которых клетки бактерий имеют неправильную раздутую форму (бактероиды) и продуцируют нитрогеназу.

8. Что такое инфекционность и эффективность симбиотических азотфиксаторов?

Штаммы ризобий различаются по 2 свойствам:

1.) инфекционность – способность проникать в ткани корней, размножаться там и образовывать клубеньки,

2.) эффективность – способность к азотфиксации. У растений вырабатывается иммунитет к заражению корневой системы ризобиями.

9. Как происходит образование клубеньков на корнях бобовых?

Механизм проникновения в корни:

Бактерии попадают из почвы на корневой волосок, затем проникают внутрь его (процесс инокуляции). Корневой волосок изгибается в виде ручки зонта, деформируется, в этом процессе участвует специальный фермент ризобий, внутри корневого волоска образуется трубчатая структура из растущей внутрь клетки целлюлозной оболочки корневого волоска – это инфекционная нить, внутри нее слизистая масса, в которую погружены клетки размножающихся бактерий. Нить передвигается к основанию волоска вглубь корня, разветвляется. Бактерии по нити проникают в новые клетки.

Инфицирование растительных клеток вызывает их безудержное деление, а также деление соседних незараженных клеток, в результате деления образуется клубенек, бактерии, увеличиваются, но продолжают размножаться, затем они перестают делиться, набухают, занимают большую часть растительной клетки — это бактероиды, они содержат нитрогеназу, которая активно работает и обеспечивает азотфиксацию.

Ризобии в симбиозе с бобовыми образуют очень сложную систему, которая обеспечивает фиксацию молекулярного азота.

Количество азота, внесённого в почву бобовыми растениями за счёт деятельности клубеньковых бактерий, достигает 100 — 250 кг/га за сезон.

10. Какие микроорганизмы преимущественно фиксируют азот в водных экосистемах?

В водной среде и на очень влажной почве непосредственную фиксацию атмосферного азота осуществляют цианобактерии (способные также к фотосинтезу).

11. Опишите морфологию, культурные и биохимические

свойства свободноживущих азотфиксаторов, водных и

почвенных?

Свободноживущие азотфиксирующие бактерии связывают несколько десятков килограммов азота на 1 га в год.

Род Clostridium— Это анаэробная бактерия, вызывающая маслянокислое брожение, имеет палочковидные клетки длиной 1,5—8 мкм и шириной 0,8—1,3 мкм. Молодые клетки несут перитрихально расположенные жгутики, в старых образуются споры. При спорообразовании клетки утолщаются посередине или на конце. В присутствии кислорода воздуха C. pasteurianum может развиваться только при наличии в среде аэробных бактерий, поглощающих кислород; организм малочувствителен к реакции среды и встречается как в кислых (рН 4,5—5,5), так и в щелочных (рН 8—9) почвах.

Источником азотного питания для бактерий рода Clostridium могут служить соли аммония, азотной кислоты и многие содержащие азот органические соединения. При отсутствии указанных соединений бактерии усваивают молекулярный азот. разлагает их с образованием масляной и уксусной кислот, диоксида углерода и водорода.

Клетки бактерий рода Beijerinckia имеют круглую, овальную или палочковидную формы; палочки иногда искривлены. Размеры молодых клеток 0,5-2,0 х 1,0-4,5 мкм. Встречаются подвижные и неподвижные формы. Цист и спор не образуют. Культуры характеризуются медленным ростом. Типичные колонии формируются обычно через 3 недели при 30°С. Большинство культур Beijerinckia образует на безазотном агаре с глюкозой выпуклые, нередко складчатые, блестящие слизистые колонии очень вязкой консистенции. (В почве в тропических зонах)

Род Azotobacter — Молодые клетки азотобактера представляют собой палочки размером 2-3 х 4-6 мкм. Позже они превращаются в крупные кокки диаметром до 4 мкм. Кокковидные клетки обычно покрыты капсулой и содержат разные включения (жир, крахмал, поли-В-гидроксимасляную кислоту и др.). У кокковидных клеток некоторых видов азотобактера появляется толстая оболочка, и они превращаются в цисты. На одних питательных средах палочки быстро приобретают кокковидную форму, на других лишь по истечении длительного времени. Палочковидные клетки азотобактера имеют жгутики и обладают подвижностью. При переходе палочек в кокки жгутики обычно теряются. (Нейтральные щелочные почвы)

В водной среде основные азотфиксаторы — это цианобактерии

12. Каковы культуральные свойства свободноживущих

азотфиксаторов на среде Эшби?

Для накопления свободноживущих азотфиксаторов используют среду Эшби, не содержащую минеральных и органических источников азота. Среду разливают в колбы слоем 1-1,5 см, заражают почвой и инкубируют при температуре 28-30 °С.

Через 5-7 суток на поверхности среды образуется жирная пленка, сначала серовато-белая, а затем постепенно буреющая. Микроскопируя пленку, можно обнаружить клетки азотфиксирующих бактерий. (В нижней части среды начинается брожение, сопровождающееся выделением газа с запахом масляной кислоты)