микробиология лаба 6

МИКРОБИОЛОГИЯ ЛАБА 6

1. Что такое колонии бактерий?

Колония бактерий — изолированное скопление клеток бактерий одного вида, формирующееся на поверхности или внутри питательных сред в результате размножения одной или нескольких бактериальных клеток. Колонии видны невооружённым глазом, а могут быть и прозрачными.

2. Как получить изолированные колонии микроорганизмов?

Получение изолированных колоний на твердой питательной среде достигается либо путем рассева взвеси микроорганизмов шпателем (метод Коха), либо с помощью бактериологической петли (метод истощающего штриха). В результате механического разобщения клеток микроорганизмов каждая из них может дать начало изолированной колонии одного вида микробов.

Рассев шпателем (метод Коха) производят в следующей последовательности:

1) на поверхность питательной среды в чашке № 1 наносят стерильной пипеткой каплю накопительной культуры и распределяют ее стерильным шпателем;

2) шпатель достают, чашку быстро закрывают и переносят шпатель в чашку № 2, не стерилизуя его. Имитируют распределение культуры по всей поверхности среды, прикасаясь к ее поверхности той же стороной шпателя, которой ранее распределяли пробу;

3) точно те же действия проводят и в чашке № 3, после чего шпатель стерилизуют;

4) засеянные чашки помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре.

Через определенное время чашки достают из термостата и изучают рост

микроорганизмов. Обычно в чашке № 1 наблюдают сплошной рост

бактерий, в последующих чашках отмечают колонии.

Рассев петлей (метод истощающего штриха) предполагает высев бактериологической петлей

из накопительной культуры на поверхность

агаризованной среды в чашках Петри. На первом этапе петлей с культурой наносят ряд параллельных штрихов на агаризованной среде (рисунок 6.2, А). Петлю стерилизуют, остужают о незасеянную часть агаризованной среды и проводят серию штрихов в направлении, перпендикулярном первым (рисунок 6.2, Б).

Затем петлю вновь стерилизуют, остужают и штрихи наносят в направлении В (рисунок 6.2), а после очередной стерилизации – в направлении Г (рисунок 6.2). Чашки помещают в термостат и через определенное время учитывают результаты. Обычно на штрихах А и Б вырастает большое число колоний (иногда сплошной рост), тогда как на штрихах В и Г формируются изолированные колонии.

3. Дать определение понятию «культура микроорганизмов»

Культура — это совокупность всех микроорганизмов, выросших на определённой питательной среде

4. Как получить чистую культуру?

Чистая культура — потомство микроорганизмов, полученное из одной материнской колонии

Первый этап. Получение накопительной культуры

Накопительная культура – это культура, состоящая из микроорганизмов со схожими физиологическими свойствами. Накопительную культуру получают при выделении чистой культуры микроорганизма из какого-либо материала или природного субстрата (например, воды, воздуха, почвы), в котором данный микроорганизм находится в небольшом количестве. Накопительную культуру получают в элективных условиях, способствующих развитию выделяемого микроорганизма и ограничивающих рост сопутствующих.

Второй этап. Выделение чистой культуры

Выделение производят путем изолирования отдельных микробных клеток микроорганизма одним из специальных приемов. Основным метолом выделения чистых культур микроорганизмов до настоящего времени является метод, предложенный Р.Кохом. По методу Коха разбавленную суспензию накопительной культуры высевают «истощающим штрихом» на поверхность плотной, как правило, дифференциально-диагностической питательной среды для получения из отдельных клеток суспензии изолированных колоний. Выросшая колония обычно состоит из клеток, являющихся потомством одной клетки и является чистой культурой

Третий этап. Проверка чистоты и идентификация выделенной культуры

Чистоту культуры, т.е. отсутствие в ней микроорганизмов другого вида, можно установить либо путем микроскопирования, либо путем рассева на поверхность плотной питательной среды с последующим анализом выросших колоний. Идентификацию чистой культуры проводят путем установления ее культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков и сравнения их с признаками музейной культуры.

Че-то нашла, хз оно или нет ↓

I этап (нативный материал)

Микроскопия (ориентировочное представление о микрофлоре). Посев на плотные питательные среды (получение колоний).

II этап (изолированные колонии)

Изучение колоний (культуральные свойства бактерий). Микроскопическое изучение микробов в окрашенном мазке

(морфологические свойства бактерий).

Посев на скошенный питательный агар для выделения чистой культуры.

III этап (чистая культура)

Определение культуральных, морфологических, биохимических и других свойств для идентификации культуры бактерий

5. Как выделить чистую культуру микроорганизмов на жидкой питательной среде?

Метод разбавлений Пастера.

Из суспензии, содержащей смесь микроорганизмов, делается ряд последовательных разведении в стерильной жидкой питательной среде. С каждым разведением количество микроорганизмов, попадающих в пробирку, будет уменьшаться и можно таким образом получить такие разведения, когда в объеме среды в пробирке будет находиться только одна клетка, из которой и разовьется чистая культура. Однако этот метод не всегда дает возможность получить чистую культуру и в настоящее время практически мало используется.

Выделение чистой культуры из одной клетки капельным методом.

Предварительно подготавливается разведение культуры микроорганизма в питательной среде с таким расчетом, чтобы в небольшой капле этой среды

могли быть единичные клетки.

Затем на поверхность стерильного стекла с помощью простерилизованной иглы и стеклянной палочки наносят ряды мелких капель среды, содержащей микроорганизмы. Стекло перевертывают и помещают над лункой предметного стекла. Края лунки предварительно обмазывают вазелином.

Затем все капли просматривают под микроскопом и отмечают те из них, в которых находится только одна клетка. Стекло помещают в чашку Петри, на дне которой находится увлажненная фильтровальная бумага, и ставят в термостат; клетка размножается, образуя микроскопическую колонию.

Полученную колонию снимают стерильной фильтровальной бумагой, которую держат простерилизованным на пламени пинцетом, и переносят в пробирку с питательной средой. Выделение чистой культуры капельным методом используется при работе с крупными микроорганизмами (дрожжи, плесени).

Выделение чистой культуры с помощью микроманипулятора.

Для выделения под контролем микроскопа одиночных микробных клеток и их посева применяют специально оборудованные микроскопы - микроманипуляторы. Отдельные микробные клетки в них вылавливаются из висячей микрокапли микропипеткой и микропетлей, перемещаемыми в поле зрения микроскопа с микронной точностью с помощью системы винтов и рычагов

6. Что такое штамм микроорганизмов?

Культуры микроорганизмов одного и того же вида, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначаются номерами или какими-либо символами.

7.Каков примерный состав микрофлоры воздуха

иот чего он зависит?

В воздухе могут встречаться до 100 видов сапрофитных микроорганизмов:

пигментообразующие бактерии (микрококки, жёлтая сарцина, палочка чудесной крови и др.), спорообразующие микробы (дрожжи, плесневые грибы, актиномицеты), споровые палочки (B. subtilis, B. megaterium, B. cereus),

которые наиболее устойчивы к действию прямого солнечного света и высушивания.

Количество микробов в воздухе открытого воздушного пространства

колеблется от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч в 1 мм3. Это зависит от степени загрязнённости воздуха частицами пыли, от температуры, от характера местности, осадков, влажности, от населённости, от времени года и т.д. Чем выше концентрация в воздухе пыли, дыма, копоти, тем больше микробов, т.к. каждая частица адсорбирует на поверхности множество микроорганизмов

Воздух больших городов содержит большие количества микроорганизмов,

а воздух лесов, гор, полей, лугов и также воздух над водной поверхностью отличается сравнительной чистотой. Особенно мало микроорганизмов в

воздухе хвойных лесов, над ледяными и снежными просторами Арктики. Летом воздух загрязнён больше, чем зимой. Атмосферные осадки способствуют очищению воздуха от микробов.

Много микроорганизмов содержится в воздухе закрытых помещений. Патогенные микроорганизмы: гноеродные кокки, микобактерии туберкулёза, дифтерийная палочка, палочка коклюша, стрептококки, бактерии туляремии, риккетсии и другие. Некоторое время они могут находиться в воздухе, что связано с их устойчивостью к высушиванию и действию УФ-лучей. Через воздух они могут передаваться вместе с каплями слизи и мокроты при чихании, кашле, разговоре.

8. Как производится подсчёт численности

микрофлоры воздуха?

Количественный учет микрофлоры воздуха.

Для исследования общего количества микроорганизмов в воздухе применяют наиболее простой, хотя и недостаточно точный, метод «оседания» (седиментационный метод), предложенный Кохом (1881).

Стерильные чашки Петри с питательной средой (МПА (мясо-пептонный агар) — для бактерий, СА (сусловый агар) — для грибов) открывают в исследуемом помещении на 5 минут (чашки располагают на высоте,

соответствующей уровню дыхания сидящего или стоящего человека). Следят за тем, чтобы при открывании крышки чашки Петри не было движения воздуха.

После этого чашки закрывают и помещают на сутки в термостат при 37°С, что дает возможность развиться бактериальной флоре.

Затем чашки переставляют в термостате и выдерживают при температуре 25°С. В таких условиях прорастают бактерии, требующие для своего развития более низкие температуры, а также плесневые грибы. Обычно опыт ставится в двух повторностях.

Затем подсчитывают выросшие колонии микроорганизмов. Счет колоний на чашках производят с помощью прибора для счета колоний бактерий или лупы. Для лучшей видимости считают колонии на темном фоне (под чашку кладут темную бумагу), чашки помещают дном кверху.

9. Что такое культуральные признаки?

Культуральные признаки – это видимые характеристики, которые могут быть выявлены при росте и размножении бактерий в искусственных условиях на питательных средах. Особенности роста (культуральные свойства) могут помочь при определении систематического положения микроорганизма. В зависимости от условий, в которых существует микробная популяция, клетки могут находиться в состоянии суспензии, образовывать микроколонии и обрастания в жидких средах или колонии, штрихи или газон на твердых средах. При развитии на твердых питательных средах колонии могут формироваться на поверхности или в толще среды

10. Какие бывают колонии по форме, краю,

поверхности, цвету и т.д.?

По размерам бывают крупные — 4—6 мм, средние — 2—4 мм, точечные— менее 1 мм

По форме бывают — круглая; круглая с фестончатым краем; круглая с валиком по краю; ризоидная; с ризоидным краем; амебовидная; нитевидная; складчатая; неправильная; концентрическая; сложная

По окрасу бывают– бесцветные и окрашенные По рельефу бывают — плоские, плосковыпуклые, выпуклые,

куполообразные, с приподнятой серединой или вдавлением в центре По характеру поверхности бывают — гладкие, морщинистые,

блестящие, матовые, влажные, сухие, слизистые и т.д По консистенции бывают — плотные, мягкие, слизистые, хрупкие,

мучнистые и т.д.

Края бывают — гладкий; волнистый; зубчатый; лопастный; неправильный; реснитчатый; нитчатый; ворсинчатый; ветвистый

При развитии культуры в жидких средах отмечают степень помутнения, наличие и внешний вид пленки на поверхности среды или осадка на дне сосуда. Образование пены и пузырьков связано с выделением газов.

Несмотря на множество признаков, которыми различаются колонии, большинство микроорганизмов образуют на средах один из четырех

морфотипов колоний:

–гладкие, или S-колонии имеют ровные края, гладкую поверхность; они выпуклые, блестящие. S-формы микроорганизмов более вирулентны (исключая Y. pestis, B. anthracis). Такой вид колоний обусловлен присутствием в составе наружных оболочек микроорганизмов гидрофильных полисахаридов.

–шероховатые, или R-колонии имеют неровный край, исчерченную поверхность, они плоские, не блестят. R-формы микроорганизмов часто авирулентны. Такой вид колоний связан с гидрофобностью наружных оболочек бактерий из-за отсутствия в них гидрофильных полисахаридов.

–слизистые, или мукоидные, или М-колонии – у клебсиелл, имеющих выраженную полисахаридную макрокапсулу;

–карликовые, или D-колонии – у микоплазм и L-форм; видны только под малым увеличением микроскопа.

Под действием ряда факторов может происходить переход бактерий из S- в R- формы, называемый диссоциацией.

11. Что такое водорастворимые и

водонерастворимые пигменты?

Спирторастворимые (каротиноиды) и нерастворимые (птерины, мелани-

ны) тесно связаны с клеткой (хромофорные) и окрашивают только колонии микроорганизмов.

1.Нерастворимые в воде пигменты (липохромы) обычно окрашивают колонии бактерий (например, желтый, золотистый, палевый пигменты стафилококков), а растворимые - окрашивают питательную среду (синегнойная палочка).

2.Нерастворимые в воде и даже сильных кислотах

а)пигменты черного или коричневого цвета - меланины - синтезируются облигатными анаэробами Bacteroldlesnlger и др;

к пирроловым пигментам ярко-красного цвета относится продигиозин.

Водорастворимые (феназиновые, пиразиновые) способны диффундировать в окружающую среду и окрашивают не только колонии микроорганизмов, но и питательные среды. Водорастворимые фенозиновые пигменты, например пиоцианин, продуцируются синегнойными бактериями (Pseudomonas aeruginosa). При этом питательная среда с нейтральным или щелочным рН окрашивается в синезеленый цвет.

Пигментообразование у микроорганизмов имеет определенное физиологическое значение. Пигменты защищают микробную клетку от природной ультрафиолетовой радиации, принимают участие в процессах дыхания, некоторые обладают антибиотическим действием (продигиозан).