Методические указания к практическому занятию № 9

Тема: «Определение групп крови и резус принадлежности» Цели занятия: познакомить студентов с основными и второстепенными антигенными

системами крови человека и изучить способы определения групп крови по системам АВО и резусфактор.

Учебная карта занятия

Антигенные системы крови

Изучением антигенных систем крови занимается наука - изосерология. В настоящее время открыто и описано более 500 антигенов крови. Более половины из них находятся на поверхности эритроцитов, а остальные представлены на других клетках крови или белках плазмы.

Согласно современным данным выделяют следующие группы антигенов крови.

2) Плазменные – определённые комплексы аминокислот на поверхности молекул белков плазмы крови. В настоящее время описано более 10 белковых антигенных систем – Hp, Gc, Tf, Jm, Gm и 25 различных ангигенов иммуноглобулинов.

Клеточные антигены обладают следующими двумя основными свойствами. Первое свойство - иммуногенность – это способность антигенов индуцировать выработку антител при введении в

чужеродный организм. Второе свойство - серологическая активность – это способность антигенов соединяться с соответствующими антителами.

В строении антигена выделяют три части: шлеппер, гаптер и эпитоп.

Шлеппер является белковой составляющей антигена, он расположен внутри цитоплазматической мембраны клетки и именно эта часть определяет свойство иммуногенности.

Гаптер – это полисахаридная часть антигена, которая также расположена в мембране клетки и эта часть антигена определяет его серологическую активность.

Концевым элементом антигена является эпитоп. По своему строению этот структурный компонент относится к углеводам, и именно эта часть антигена осуществляет соединение с соответствующим антителом при иммунологических реакциях. Эпитопы антигенов системы АВО отличаются по своему химическому строению. Так антиген О имеет эпитоп фукозу, у антигена А эпитоп - N – ацетилгалактозамин, а у антигена В эпитоп галактоза

На данный момент различают следующие разновидности клеточных и плазменных антигенов

крови.

1. Эритроцитарные антигены насчитывают – около 20 изученных антигенных систем. Клиническое значение имеют системы: АВО, Резус фактор, MNSs, Келл, Лютеран, Кидд, Диего, Даффи, Домброк, ферментативные группы Эр.

Среди этих систем выделяют основные и второстепенные антигенные системы. К основным системам относят: систему АВО и резус фактор.

Остальные антигенные системы относят к второстепенным. Но среди них есть ряд антигенов, которые имеют определённое клиническое значение.

Антигены системы МNSs (2 локуса МN и Ss) определяют при трансплантации органов. Система Келл (АГ - Келл и Челлано) играет достаточно важное значение при переливании крови. Антитела к антигенам системы Келл способны вызвать гемотрансфузионные осложнения, а также повлиять на неблагоприятное течение второй и последующих беременностей вызывая антигенный конфликт между организмом матери и плода. Аналогичное клиническое значение имеет система Кидд, антигены которой имеют 75% людей.

Антигены системы Р (1927 г. Ландштейнер и Левин), Лютеран (Lu a, Lu b) и Домброк (До а (5560%), До в (85-90%)) имеют малое клиническое значение, но в то же время при переливании крови возможно формирование антител к антигенам данных систем, что может стать причиной осложнений при повторных переливаниях крови.

1

Ряд антигенных систем, таких как Диего (АГ-рассовый признак монголоидов) и Даффи (негроиды – 25% (Fy a), китай, австралия, эскимосы – 100%, европейцы – 60-82%) имеют чёткую расовую избирательность, что можно использовать при антропологических исследованиях и в судебной медицине для определении расовой принадлежности и установления отцовства.

Наконец, одной из наименее изученных антигенных систем эритроциратных антигенов являются ферментативные группы эритроцитов (фосфат глюкомутаза, аденозиндезаминаза, глютамат

– пируват – трансаминаза, эстераза Д и т.д.). Эти антигены находятся на стадии изучения и их клиническое значение до конца не определено.

2. Лейкоцитарные антигены были открыты Ж. Доссе в 1954 году. Среди них выделяют общие лейкоцитарные антигены, а также клеточно-специфичные антигенные системы.

К общим антигенам лейкоцитов относят систему HLA. Эта система включает более 120

антигенов. Особенностью этих антигенов является то, что они представлены не только на клетках крови, а именно на лейкоцитах, лимфоцитах, моноцитах и тромбоцитах. Эти антигены характерны для клеток внутренних органов человека, таких как клетки печени, почек, лёгких, костного мозга, и других органов. По этой причине антигены системы HLA называют антигенами гистосовместимости и их определение является обязательным перед трансплантацией костного мозга и внутренних органов. Совпадение антигенов донора и реципиента более 80% считается достаточным для пересадки органа или ткани, но при этом возможно развитие реакции «донорский орган против хозяина». Совпадение более 95% антигенов системы HLA приравнивается к полной совместимости организма реципиента и донорского органа и это существенно снижает риск отторжение органа после пересадки. В клинической практике систему HLA также используют при переливании лейкоцитарного и тромбоцитарного концентрата. Кроме того, в ряде случаев антигенная несовместимость матери и плдода может стать причиной выкидыша или мертворождения, что имеет важное значение в акушерстве и планировании беременности.

(Номенклатура: HLA – обозначение системы, А,В,С,Д – генные локусы или регионарные системы, 1,2,3 – номер аллелей внутри локуса НLА, W – недостаточно изученные АГ).

Клеточно-специфичные лейкоцитарные антигены включают антигены полиморфноядерных нейтрофилов (NA-1, NA-2, NB-1) и лимфоцитов (LY) (В – лф (HLA – DRw1 - DRw7)). Кроме клеток крови антигены нейтрофилов обнаружены также на клетках костного мозга, что учитывают при его пересадке. Клиническое значение клеточно-специфичных антигенов нейтрофилов включает возможность наличие кратковременной нейтропении у новорожденных, развитие негемолитических посттрансфузионных осложнений, а также может стать причиной сокращения жизни донорских гранулоцитов при переливании лейкоцитарной взвеси или при пересадке костного мозга.Клиническое значение специфичных антигенов лимфоцитов в настоящее время находится на стадии изучения.

3. Тромбоцитарные антигены (Zw, Pl, Ko). В настоящее время эта группа антигенов не имеет важного клинического значения, но тем не менее при пересадке костного мозга и переливании тромбоцитарного концентрата определение этих антигенов желательно, а в ряде случаев более, чем необходимо.

Понятие о группе крови

Группой крови называют сочетание нормальных иммунологических и генетических признаков крови, которое наследственно детерминировано и является биологическим свойством каждого индивидуума. Группа крови передаётся по наследству, формируется на 3-4 месяце внутриутробного развития и не меняется с возрастом.

На практике групповая принадлежность крови включает определение антигенов и антител систем АВО и резус фактора.

Определение группы крови по системе АВО Система АВО формируется на 3-4 месяце внутриутробного развития и включает несколько

видов антигенов и антител. Антигены системы АВО называют агглютиногенами, а антитела этой системы носят название агглютинины.

К агглютиногенам системы АВО относят: антигены А, В, О и субстанцию Н.

Антиген А имеет две разновидности – антиген А1 (88%) и антиген А2 (12%). По своим иммуногенным и агглютинабельным свойствам антиген А1 является более активным, в то же время эти свойства у антигена А2 выражены более слабо. Поэтому антиген А1 называют сильным, а антиген А2 – слабым.

Антиген В имеет порядка 4-5 разновидностей: В1,В2, В3, В4, ВW. Антигенные свойства этих белков мало отличаются друг от друга и потому клинического значения не имеют, а антиген В считается более однородным, нежели антиген А.

2

Агглютинины системы АВО. Вторым компонентом системы АВО являются антитела α, и β. По своей характеристике эти антитела являются врождёнными, относятся к иммуноглобулинам класса М и потому называются полными. Эти антитела имеют 10 активных центров и являются холодовыми, то есть они вступают в реакцию агглютинации лучше при температуре ниже 36*С. Наличие 10 активных центров позволяет этим антителам присоединять сразу несколько эритроцитов, что даёт хорошо видимую реакцию агглютинации при определении групповой принадлежности крови.

Взаимодействие антигена и антитела проходит две фазы:

1)фаза взаимодействия – соединение антигена и антитела без видимых изменений среды,

2)фаза проявления: агглютинация (склеивание Эр вокруг антитела) присоединение комплемента и последующий лизис эритроцитов под действием комплемента (гемолиз крови).

Развитие лизиса эритроцитов и гемолиза крови является завершающим этапом иммунологической реакции при переливании несовместимой крови.

По соотношению этих антигенов и антител выделяют 4 основные группы крови по системе АВО. Эритроциты первой (О(I)) группы не содержат на своей поверхности антигенов, а в плазме крови

имеются врождённые антитела α, β. Эритроциты второй группы (А(II)) содержат антиген А1 или А2, а в плазме имеется антитело β. Эритроциты третьей группы (В (III)) содержат антиген В, а в плазме крови находится антитело α. И, наконец, эритроциты четвёртой группы (АВ (IV)) содержат одну из разновидностей антигена А, антиген В, а в плазме крови у таких людей нет врождённых антител.

Наличие сильного и слабого антигена А у людей со второй и четвёртой группой крови при переливаниях разнородных антигенов приводит к формированию изоиммунных антител, которые получили название экстраагглютинины. Поступление в организм человека с сильным антигеном А1 слабого антигена А2 приводит к образованию экстраагглютинина α2. В то же время поступление в организм человека, имеющего слабый антиген А2, сильного антигена А1 становится причиной выработки экстраагглютинина α1.

Экстраагглютинины α1 и α2 отличаются от врождённых антител. Это изоиммунные антитела

ипотому присутствуют не у всех людей, а только у иммунокомпроментированных. Относятся они к классу иммуноглобулинов G, имеют всего 2 активных центра и, потому их называют неполными.

Кроме вышеуказанных антигенов на эритроцитах могут присутствовать ещё 2 антигена системы АВО: антиген О и субстанция Н.

Антиген О впервые был обнаружен на эритроцитах I группы крови. Позднее его присутсиве было выявлено на эритроцитах II и IV группы крови, со слабым антигеном А2.

Субстанция Н считается веществом - предшественником антигенов системы АВО. Данная субстанция в той или иной мере содержится на эритроцитах всех четырёх групп крови, но в большем количестве она присутствует на эритроцитах I группы крови, а на эритроцитах остальных групп крови она встречается в незначительном количестве.

При изучении антигенной системы крови в конце прошлого столетия у жителей центральной части Индии был выявлен «бомбейский феномен». На эритроцитах этих людей не был обнаружен ни один антиген системы АВО, но в то же время плазма крови этих людей содержала 4 вида агглютиногенов, а именно α, β, анти – О, анти – Н.

Кровяные химеры – это организмы, в крови которых содержаться эритроциты двух разных подтипов. В естественных условиях этот феном очень кратковременно можно наблюдать у близнецов в первые недели после рождения. Кроме того это возможно при пересадке аллогенного костного мозга с другой групповой принадлежностью или после переливания массивных объёмов крови. При попытке определения группы крови у химер результат исследования получается искажённым. Непременным условием существования кровяной химеры является иммунная супрессия. Только при резком снижении или отсутствии иммунного ответа эритроциты с чужеродным набором антигенов могут сохранить целостность и не подвергнуться лизису. В тех случаях, когда это состояние сохраняется в течение 4-6 недель, то возможна постепенная естественная гибель чужеродных эритроцитов и возвращение исходной индивидуальной антигенной структуры крови.

Способы определения групп крови по системе АВО в клинике

Существует три основных способа определения группы крови по системе АВО: 1) определение группы крови стандартными изогемагглютинирующими сыворотками, 2) перекрёстный метод или определение группы крови с помощью стандартных эритроцитов и 3) определение группы крови с помощью цоликлонов (моноклональные антитела).

1. Определение группы крови стандартными сыворотками

Для определения группы крови в данном случае необходимы следующие компоненты: 1) стандартные изогемагглютинирующие сыворотки 1, 2, 3 группы по две серии каждая и одна серия

3

стандартной сыворотки 4 группы, 2) планшет со смачиваемой поверхностью, 3) изотонический раствор NaCl, 4) иглы (скарификатор), 5) пипетки, 6) палочки (предметные стёкла) для смешивания реагентов, 7) спиртовые шарики для обработки кожи.

Перед постановкой реакции необходимо произвести макроскопическую оценку имеющихся стандартных сывороток. Каждая из сывороток должна быть прозрачной, без признаков гниения и порчи, в ней не должно быть ни каких включений. На этикетке должна быть отметка о сроках годности, титр не ниже 1/32, а для сыворотки 3 группы титр не ниже 1/16. Сыворотки должны храниться при температуре 4-8*С. Кроме того каждая из сывороток имеет свой цвет: 0 – без цвета, А – синяя, В –

красная, АВ – жёлтая.

Методика постановки реакции. Первоначально необходимо подписать планшет и указать на нём ФИО пациента. Далее в каждую лунку помещают по 1 капле сыворотки 1, 2, 3 групп каждой из двух серий. После этого с помощью скарификатора получают кровь из пальца и с помощью предметного стекла или стерильной палочки вносят в лунку рядом с сывороткой каплю крови больного. Соотношение капли крови и сыворотки должно составлять 1:10. После смешивания капель в каждой из лунок индивидуальными палочками или уголками предметного стекла, наблюдают за течением реакции слегка покачивая планшет. Время постановки реакции составляет 5 минут. Через 3 минуты в лунки, где имеется подозрение на агглютинацию, добавляют изотонический раствор натрия хлорида и наблюдают течение процесса ещё 2 минуты. В том случае, если агглютинация произошла, при добавлении физ. раствора наблюдается просветление среды, а агглютинаты становятся более чёткими. В том же случае, если это была псевдоагглютинация, которая является следствием обратимого склеивания эритроцитов с формированием монетных столбиков, добавление физиологического раствора нарушает склеивание эритроцитов и возвращается равномерная окраска содержимого лунки.

Постановка реакции в течение 5 минут необходима для того, чтобы выявить позднюю агглютинацию с антигеном А2. По окончании реакции производят интерпретацию результатов (табл.

1).

Таблица 1 – Результаты определения группы крови по системе АВО

с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток

Примечание: (+) - есть агглютинация, (–) - нет агглютинации Лабораторный метод идентификации сильного и слабого антигенов А1 и А2 проводят путём

постановки реакции агглютинации с различными экстрактами растений, которые имеют тропность к каждому из них (А1 – агглютинирует с экстрактом семян Dolichos biflorus, А2 – агглютинирует с экстрактом семян Ulex Europeus).

2. Определение групп крови стандартными эритроцитами

Для постановки реакции, которая проводится только в условиях лаборатории, необходимы стандартные эритроциты I, II, и III групп, заготовленные из крови доноров с соответствующими группами крови. Взятые у доноров эритроциты хранят не более 2-3 суток, при температуре 4-8*С. Кроме стандартных эритроцитов для постановки реакции необходима сыворотка крови пациента, физиологических раствор, планшет и палочки для смешивания реагентов. Методика постановки реакции практически не отличается от описанной ранее. На планшет в каждую из 6 лунок вносят по капле сыворотки пациента, затем добавляют в 10 раз меньшую каплю стандартных эритроцитов I, II, III групп двух серий, после чего содержимое лунок смешивают и наблюдают за реакцией в 5 минут. По окончании времени постановки реакции в лунки, подозрительные на агглютинацию добавляют физиологический раствор и интерпретируют полученный результат (табл. 2).

Таблица 2 – Результаты определения группы крови по системе АВО

с помощью стандартных эритроцитов

4

Примечание: (+) - есть агглютинация, (–) - нет агглютинации

Результат перекрёстного способа считается достоверным, если совпадает с результатом групповой принадлежности крови, полученным при реакции со стандартными сыворотками. Если результаты реакции не совпадают, необходима повторная постановка обеих реакций.

3. Определение групп крови моноклональными антителами

В 1975 году для определения групповой принадлежности крови были получены моноклональные антитела – цоликлоны. Для получения моноклональных антител путём генной инженерии были созданы два вида гибридных клеток – гибридом за счёт слияния генетического материала клетки опухоли костного мозга и иммунного В лимфоцита. Полученные в результате этого слияния клетки способны к неограниченному делению и продукции антител против антигенов А или В. Полученные моноклональные антитела лиофилизируют, а затем в клинике и лаборатории их разводят в физиологическом растворе и получают два жидких реагента – цоликлон анти – А и цоликлон анти – В. Цоликлон анти-А имеет розовую окраску, а цоликлон анти- В имеет голубой цвет.

Методика постановки реакции. Для определения группы крови с помощью цоликлонов необходим планшет, цоликлоны анти-А и анти-В, скарификатор для получения крови, предметные стёкла или палочки для смешивания, спиртовые шарики и кровь пациента. Первоначально планшет маркируют ФИО пациента, затем наносят 2 капли цоликлонов, по одной капле цоликлона анти-А и анти-В. Затем в каждую лунку рядом с каплей цоликлонов вносят каплю крови больного в 10, раз меньше капли цоликлонов. После этого содержимое лунок смешивают индивидуальными палочками. Время постановки реакции составляет 3 минуты, после чего интерпретируют полученный результат

(табл. 3).

Таблица 3 – Результаты определения группы крови по системе АВО

с помощью цоликлонов

Примечание: (+) - есть агглютинация, (–) - нет агглютинации

Возможные ошибки и сложности при определении групповой принадлежности крови

На полученный в ходе постановки реакции результат могут оказать своё влияние следующие факторы:

1)низкое качество реагентов – при этом наблюдается снижение агглютинабельных свойств сывороток крови при истечении срока годности, низком титре или при наличии признаков их порчи,

2)технические ошибки:

-недостатки внешней среды - плохая освещённость, температура в помещении более 25* или ниже 15*С (в этом случае возможна неспецифическая холодовая панагглютинация),

-нарушение техники постановки реакции - неверное расположение сывороток на планшете, нарушение соотношения сыворотки и эритроцитов, ранняя оценка результатов (до проявления агглютинации с антигеном А2), не дифференциальная диагностика междлу псевдоагглютинацией (монетные столбики) и истинной агглютинацией (не внесён в подозрительные на агглютинацию лунки хлорид натрия 0,9%),

3) особенности исследуемой группы крови:

-феномен Томсена – панагглютинация - это получение агглютинации крови со всеми сыворотками. Феном был впервые описан у больных с бактериемией и тяжёлым сепсисом

-аутоагглютинация – это наличие агглютинации сыворотки больного со всеми стандартными эритроцитами, а также агглютинация эритроцитов пациента со всеми стандартными сыворотками – такое состояние было описано при заболеваниях крови, спленомегалии, циррозе печени, и некоторых инфекциях.

В том случае, если при постановке реакции невозможно интерпретировать результат первоначально необходимо исключить пседоагглютинацию, и для этого в лунки, подозрительные на агглютинацию, добавляют физиологический раствор. Псевдоагглютинация при этом исчезает.

5

Если добавление физ. раствора убедило вас в наличии агглютинации, но при этом результат не соответствует возможным вариантам необходимо исключить техническую ошибку. Для этого реакицю ставят повторно, при этом обращают внимание на все аспекты, которые могут повлиять на результат, включая температуру окружающей среды, время постановки реакции, соотношение реагентов и так далее.

В тех случаях когда повторная постановки реакции выявляет признаков панагглютинации или аутоагглютинации, необходимо помнить, что эти эффекты сохраняются только при комнатной температуре, а при температуре тела они исчезают. В таких случаях для определения группы крови пациента необходимо подогреть все реагенты и провести реакцию в термостате при температуре 37*С.

Эритроцитарная антигенная система резус-фактора

1. Антигены системы резус были открыты в 1940 году К.Ландштейнером и А. Винером, и резус фактор оказался присущ 85% людей. В то же время у 15% людей этот фактор не был выявлен на эритроцитах. Детальное исследование этой антигенной системы позволило выяснить, что кроме первоначально выявленного резус-антигена (Rh0) на поверхности эритроцитов может содержится ещё порядка 4-5 белков, принадлежащих данной антигенной системе.

Расшифровка генного кода и изучение генотипа в 70-80 годах прошлого столетия позволили узнать о том, что образование антигенов системы резус определяется 3-мя парами аллельных генов,

которые согласно номенклатуре, предложенной Фишером Р. Рейсом, условно обозначили как Dd, Cc, Ee. Каждая из 2-х хромосом несёт только 3 АГ и лишь один из каждой пары. По этой причине полученная генная информация от родителей в организме следующего поколения детей формирует свою индивидуальную антигенную систему, в которой могут присутствовать от 3 до 5 антигенов системы резус. При этом была выявлена особенность, связанная с тем, что наличие гена d у обоих родителей не сопровождалось формированием какого-либо антигена на поверхности эритроцитов, и потому этот буквенное обозначение этого гена принято считать лишь условным обозначением при определении резус принадлежности и антигенной формулы пациента. Если рассмотреть все возможные генные абберации, то мы получим достаточное разнообразие возможных антигенных систем резус фактора (табл. 4).

Таблица 4 - Возможные генотипические и фенотипические варианты системы резус

По своей структуре антигены системы резус относятся к липопротеидам и эта система формируется на 6-8 неделе внутриутробного развития. В конце ХХ века был выявлен ещё один антиген системы резус, который по своим свойствам оказался очень похож на антиген D, и потому был назван Du. При этом было выявлено, что при сочетании генов D и Du в организме фенотипически проявляется только D, а в том случае, если сочетание включает гены d и Du, то на эритроцитах присутствует антиген

Du.

Современная терминология и номенклатура антигенов системы резус включает две классификации: 1) классификация Фишера – Рейса, 2) классификация Винера. Обозначение антигенов системы резус согласно данным классификациям представлено в таблице 5.

Таблица 5 – Номенклатура антигенов системы резус

2. Антитела системы резус – фактора. В отличие от системы АВО антитела система резус фактора не имеет врождённых антител и после рождения ребёнка в его крови имеются антигены системы резус на эритроцитах, а в плазме крови нет никаких антител к этим белкам. В процессе жизни

6

формирование антител системы резус может быть спровоцировано попаданием чужеродного антигена при переливании крови, на эритроцитах которой содержаться отличные от собственного генотипа антигены, либо во время беременности при несоответствии антигенов системы резус матери и плода. При иммунизации чужеродным резус антигеном образующиеся изоиммуные антирезусные антитела содержаться не только в крови, но и во всех биологических жидкостях. Свойства антител системы резус: изоиммунные, иммуноглобулины G, содержат 2 активных центра, неполные, тепловые. Такие антитела дают видимую невооружённым взглядом агглютинацию только при постановке реакции в присутствии коллоидных средств или преципитирующей сыворотки.

Резус принадлежность доноров и реципиентов Резус принадлежность реципиента и обычного человека оценивают по наличию или

отсутствию антигена D. Его наличие говорит о положительной резус принадлежности человека, а его отсутствие расценивается как отрицательная резус принадлежность. Наличие антигена Du для обычного реципиента расценивается как резус отрицательная принадлежность крови.

Резус принадлежность донора оценивают по всем 6 антигенам, из которых наибольшее значение имеют D, C, E, а также Du. Наличие на эритроцитах любого из этих антигенов при переливании крови вызывает сенсибилизацию организма и выработку антител.

Из двух оставшихся антигенов - с и е – только антиген – е – обладает самой низкой иммуногенностью, поэтому истинной резус отрицательной кровью в настоящее время считают кровь, на эритроцитах которой после специальной обработки и удаления антигена – с – остаются только антигены d и e.

В последние годы с целью снижения иммунизации реципиентов резус антигенами и для снижения риска посттрансфузионных осложнений используют фенотипирование крови не только доноров, но и реципиентов. Определение фенотипа - это определение всех видов антигенов системы резус и системы Келл на эритроцитах реципиентов. В результате такого фенотипирования каждому пациенту подбирается донор, в крови которого не содержится чужеродных антигенов. Это позволяет избежать образования иммунных антирезусных и анти-Келл антител и снизить риск гемотрансфузионных осложнений при повторных трансфузиях.

Определение резус фактора

1.Экспресс – методы определения резус принадлежности

Вклинике используют методики определения резус фактора, которые выполняются при комнатной температуре:

1) экспресс метод в пробирке со стандартным универсальным реагентом. Универсальный реагент представляет собой смесь антирезусной сыворотки АВ (IV) группы, содержащей антитела к антигену D и 33% полиглюкин. Методика постановки реакции включает следующие этапы: на дно пробирки вносят 1 каплю универсального реагента и 1 капля крови паицента. Далее поворачивая пробирку под углом и вращая её вокруг своей оси распределяют содержимое пробирки по стенкам тонким слоем в течение 3 минут. В том случае, если антитела вступили в реакцию с антигеном, то на стенках пробирки появляются участки агглютинации и свободное пространство. В том же случае, если реакции не произошло сохраняется равномерное окрашиванеи стенок пробирки. Для подтверждения результата через 3 минуты от начала постановки реакции в пробирку добавляют 4-6 мл физ. Раствора. При наличии хлопьев резус принадлежность – положительная, а при равномерной окраске жидкости резус принадлежность – отрицательная.

2) экспресс метод с антирезусной сывороткой на плоскости. Для определения резус принадлежности на планшете указывается ФИО пациента, а также наносят две надписи – сыворотка антирезус (АТ), контроль. В первую лунку помещают большую каплю антирезусной сыворотки АВ(IV) группы крови, которая содержит антитела к антигену D. В лунку с контролем вносят каплю разведённой альбумином сыворотки АВ (/\/) резус – отрицательной группы крови, которая не содержит никаких антител и антигенов резус-системы. Далее в каждую лунку добавляют каплю крови пациента в 5 раз меньше капли сыворотки. Постановка реакции занимает 5 минут. После этого в обе лунки добавляют физ. раствор. Наличие агглютинации в лунке с антирезусной сывороткой говорит о резус – положительной принадлежности крови, а отсутствие агглютинации в этой лунке говорит о резус отрицательной принадлежности крови. В контрольной лунке с сывороткой IV группы крови агглютинации быть не должно (табл. 6).

Таблица 6 – Результат экспресс метода определения резус фактора

с помощью антирезусной сыворотки

Наличие агглютинации

7

Примечание: (+) - есть агглютинация, (–) - нет агглютинации

2. Лабораторные методы определения резус принадлежности

1) агглютинация в солевой среде. Для постановки реакции используют сыворотки содержащие полные антирезусные антитела класса JgM. На плоскости производят смешивание 2% взвеси эритроцитов пациента с антирезусной сывороткой и выдерживают при температуре 37* в течение часа. После этого производят микроскопию осадка. Положительная реакция устанавливается при наличии осадка в виде нитей или зернистости. Отрицательная реакция устанавливается при наличии ровного правильного круга на дне лунки.

2) агглютинация в присутствии желатина. В ходе постановки реакции к 1-2 каплям исследуемых эритроцитов добавляют 2 капли антирезусной сыворотки и 2-3 капли 10% желатина. Далее пробирку помещают на водяную баню при температуре 45-48* на 15-20 минут. После этого в пробирку добавляют 8-10 мл 0,9% натрия хлорида и слегка покачивают пробирку в сторону на 45-50*. Пожительная реакция устанавливается при наличии видимой невооружённым глазом агглютинации.

3) реакция Кумбса – непрямой антиглобулиновый тест. Данная реакция позволяет выявить неполные АТ к ауто- и изоантигенам Эр. Для этого в ходе реакции используют антиглобулиновую сыворотку, которая содержит антитела к иммуноглобулину человека (антитела к антителам).В ходе постановки реакции к отмытым эритроцитам, которые не содержат на своей поверхности антител добавляют антирезусную сыворотку и после этого инкубируют пробирку при 37* в течение 20 минут. После этого производят повторное отмывание эритроцитов, в ходе которого остаются только эритроциты и осевшие на их поверхность антирезусные антитела. На следующем этапе в лунку планшета вносят 1 каплю таких эритроцитов и добавляют 1 каплю антиглобулиновой сыворотки. При наличии фиксированных антител происходит видимая агглютинация, что говорит о резус положительной принадлежности крови. В том случае, если агглбтинации не произошло – резус принадлежность отрицательная.

4) реакция с моноклональными анти - D антителами. В ходе постановки реакции в лунку планшета вностят одну каплю моноклональных анти-D антител и добавляют в 10 раз меньшую каплю крови пациента. После смешивания наблюдают за реакцией в течение 3 минут. Резус принадлежность - положительная при наличии агглютинации, а отрицательная - при отсутствии реакции.

Возможные ошибки при определении резус принадлежности

Ошибки при постановке реакций могут быть связаны с неправильным соотношением сыворотки и эритроцитов, с сокращением времени наблюдения, при оценке результата по высыхающей капле, при определении резус-фактора в гемолизированной крови, при использовании неактивных, просроченных или испорченных сывороток. Биологические аспекты ошибочной диагностики резус фактора могут быть обусловлены снижением агглютинабельности резус антигенов эритроцитов при заболеваниях печени, почек, крови, а также при наличии неспецифической агглютинации.

Клиническое значение групп крови

1.Общее клиническое значение групп крови. Антигены системы крови являются маркёрами генотипа при установлении личности или отцовства. Важное значение эти антигены приобретают при наличии несовместимости плода и матери. Некоторые исследователи усматривают взаимосвязь между группами крови и риском развития инфекционных и неинфекционных заболеваний. Антигенные системы крови также используются при подборе доноров органов, а также используются в научных антропологических исследованиях.

2.Значение группы крови в гемотрансфузиологии. При переливании крови кровь донора и реципиента в обязательном порядке типируют по системе АВО и резус фактора. При этом термин групповой совместимости впервые был предложен и введён в практику Грилле (1907) и Оттенбергом (1908) в 1907-1908 годах. Согласно предположению Оттенберга в организме человека при переливании донорской крови агглютинируют только Эр переливаемой крови, а содержащиеся в этой крови агглютинины разводятся в плазме реципиента, и за счёт значительного падения их титра данные антитела инактивируются. Согласно этому утверждению было сформулировано так называемое правило Оттенберга. Согласно этому правилу кровь I группы можно переливать людям с любой группой крови и такие люди считаются универсальными донорами. В то же время людям с IV группой крови можно переливать кровь любой другой группы, и потому их называют универсальными реципиентами. Людям со II или III группой крови можно вливать одногруппную кровь или кровь I группы.

8

3. Современные правила переливания крови. В виду того, что у людей с I группой крови возможно содержание до 10-16% изоиммунных анти – А, и анти-В антител, которые образуются при беременности, вакцинации и так далее, в настоящее время разрешено переливать только

одногруппную и однорезусную кровь.

Кровь I группы разрешено переливать: 1) при наличии абсолютных показаний к переливанию и невозможности определить группу крови больного, 2) по жизненным показаниям, при отсутствии одногруппной крови, при этом объёме крови не должен превышать 500 мл.

Детям разрешено переливать только одногруппную и однорезусную кровь.

Вопросы для подготовки к занятию:

1.Перечислите основные и второстепенные антигенные системы крови человека и их клиническое значение.

2.Строение и свойства эритроцитарных антигенов и антител системы АВО.

3.Группы крови по АВО, особенности сочетания антигенов и антител, «бомбейский феномен», кровяной химеризм.

4.Определение группы крови по системе АВО с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток.

5.Определение группы крови по системе АВО с помощью стандартных эритроцитов.

6.Определение группы крови по системе АВО с помощью цоликлонов.

7.Строение и свойства эритроцитарных антигенов и антител системы резус.

8.Номенклатура и терминология антигенов системы резус.

9.Экспресс методы определения резус принадлежности.

10.Особенности резус принадлежности доноров и реципиентов, фенотипирование крови.

9