3. Микроорганизмы сырья и продукции животного происхождения: представители, методы выявления, критерии оценки качества.

Для большинства групп микроорганизмов нормируется масса продукта, в которой не допускаются группы кишечных палочек, большинство условно-патогенных микроорганизмов, а также патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы. В других случаях норматив отражает количество колониеобразующих единиц в 1 г (мл) продукта (КОЕ/г, мл).

В продовольственном сырье и пищевых продуктах не допускается наличие возбудителей паразитарных заболеваний (гельминты, их яйца, и личиночные формы). В рыбе и продуктах её переработки не допускается наличие живых личинок паразитов, опасных для здоровья человека.

Чем выше, показатель общей бактериальной обсемененности, тем больше вероятность попадания в исследуемый объект патогенных микроорганизмов – возбудителей инфекционных болезней и пищевых отравлений. Обычно в 1 г (или 1 мл) продукта, не прошедшего термической обработки, содержится не более 100 тысяч сапрофитных мезофильных бактерий. Если же их количество превышает 1 млн. клеток, то стойкость готового продукта при хранении снижается и его употребление может нанести вред здоровью человека.

Представители. Гигиенические нормативы включают контроль за следующими группами микроорганизмов:

1) санитарно-показательные:

- количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) как показатель общей бактериальной обсемененности (в колониеобразующих единицах – КОЕ/г);

- бактерии группы кишечных палочек – БГКП (колиформы) – индикаторы фекального загрязнения;

- бактерии семейства Enterobacteriaceae – широкая группа, включающая БГКП и другие энтеробактерии, индикаторы санитарного состояния;

- энтерококки – индикаторы фекального загрязнения, устойчивые во внешней среде.

2) условно-патогенные микроорганизмы (микроорганизмы, способные вызывать заболевания при определенных условиях (снижение иммунитета, высокая доза, попадание в нетипичные места обитания)): E.coli, Staphylococcus aureus, бактерии рода Proteus, Bacillus cereus, сульфитредуцирующие клостридии, парагемолитический вибрион;

3) патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы, листерии, бактерии рода иерсений (возбудители инфекционных болезней и пищевых отравлений);

4) микроорганизмы порчи (вызывают нежелательные изменения продукта (внешний вид, запах, вкус, консистенция), делая его непригодным к употреблению) – в основном это дрожжи и плесневые грибы, термоустойчивые молочнокислые микроорганизмы, газообразующие и маслянокислые бактерии;

5) возбудители паразитарных заболеваний (гельминты, их яйца и личиночные формы). Не допускаются в продовольственном сырье и пищевых продуктах;

6) технологическая и пробиотическая микрофлора (молочнокислые и пропионовокислые бактерии, бифидобактерии, дрожжи, уксуснокислые бактерии). Нормируется в ферментированных продуктах, заквасках, пробиотиках.

Методы выявления:

1) методы, основанные на накоплении микроорганизмов с последующей их идентификацией. Эти методы используются для выявления микроорганизмов, содержание которых незначительно в сравнении с общим количеством микроорганизмов. Сущность этих методов заключается в посеве продукта или его разведений на накопительные жидкие среды. Проба продукта проходит специальную обработку до получения суспензии, препарат высевается на среды и помещается в термостат. Выделенные чистые колонии микроорганизмов идентифицируют. В зависимости от задачи могут применяться разные методы посева: глубинный, поверхностный, метод мембранной фильтрации. Если после культивирования обнаруживают рост микроорганизмов (образование осадка, помутнение среды, накопление газа в поплавках), то в дальнейшем проводят пересев из пробирок, в которых замечен рост на дифференциально-диагностические среды для идентификации выросших на накопительной среде микроорганизмов.

К таким методам относятся определение наличия БГКП, сальмонелл.

Определение бактерий группы кишечной палочки.

Для посева используют то количество продукта, в котором предусматривается отсутствие БГКП (1 см³ молока или 1 см³ первого разведения молока). Посев проводят в пробирки со средой Кесслера с поплавками. Посевы помещают в термостат с температурой +37°С на 24 часа.

При отсутствии признаков роста (газообразования в поплавках, помутнения среды) дают заключение об отсутствии БГКП и соответствии исследуемого продукта нормативу на БГКП.

При положительной бродильной пробе для окончательного заключения о наличии в продуктах БГКП из подозрительных пробирок производят посев на чашки со средой Эндо или Левина. Чашки помещают в термостат.

Учет результатов. При отсутствии на среде Эндо или Левина колоний, типичных для БГКП (на среде Эндо – красных с металлическим блеском, на среде Левина – черных с металлическим блеском, темных с черным центром, сиреневых с темным центром) считают, что продукт соответствует нормативу. При наличии на среде Эндо или Левина типичных колоний их окрашивают по Граму и микроскопируют. Обнаружение грамотрицательных, не содержащих спор палочек указывает на наличие БГКП в анализируемой пробе и несоответствии продукта по микробиологическому нормативу;

2) использование элективных питательных сред (при определении условно-патогенных микроорганизмов). Например, наличие золотистого стафилококка выявляют с помощью молочно-солевого (МСА) или желточно-солевого (ЖСА) агара, а для плесеней и дрожжей используют картофельно-декстрозный агар. Продукт (или его разведения) высевают на поверхность или в глубину плотных питательных сред. Среды подбираются для подавления сопутствующей микрофлоры и идентификации целевых микроорганизмов по характерным признакам колоний (цвет, гемолиз, ферментация сахаров);

3) использование накопительных питательных сред. Для определения сальмонелл используют накопительные питательные среды (селенитовую, Кауфмана, Мюллера) и дифференциально-диагностические среды (Плоскирева, Левина);

4) бактериоскопическое исследование (мясо). Отбираются отпечатки с поверхности мясных продуктов, отпечатки окрашивают по Граму, подсчитывают количество бактерий, проводят их качественный анализ (по морфологическим признакам, тинкториальным свойствам (окраске по Граму), по наличию спор/капсул, выявляют грубоге загрязнение (плесень, дрожжи)) и регистрируются отклоняющиеся от нормы изменения (присутствие дрожжей, плесени);

5) для молока применяют чашечный метод посева на твёрдую питательную среду с последующим культивированием в течение 72 часов при 30-37°С и подсчётом колоний-образующих единиц (КОЕ) мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ);

6) для молока применим ещё и метод редуктазной пробы — экспресс-метод, основанный на восстановлении резазурина окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По интенсивности изменения окраски резазурина через 1 час оценивают уровень бактериальной обсеменённости сырого молока. Скорость обесцвечивания коррелирует с обсемененностью;

7) метод мембранной фильтрации. Для жидких продуктов с низкой обсемененностью (вода, некоторые напитки). Пропускают определенный объем через мембранный фильтр, который затем помещают на поверхность питательной среды и инкубируют;

8) для рыбы применяют метод микроскопирования с целью выявления количественной характеристики микробного разнообразия, основанный на прямом подсчёте бактериальных клеток с помощью методов оптической микроскопии;

9) для рыбы применим метод молекулярно-генетического анализа для идентификации некультивируемых микроорганизмов. Например, секвенирование рибосомных генов посредством выделения ДНК и амплификации, а также групп- и видоспецифичная гибридизация;

10) для яиц используют одновременное исследование микрофлоры на поверхности скорлупы и содержимом яйца. Например, делают смывы с поверхности скорлупы яиц методом тампона, ополаскивания или измельчения;

11) содержимое яиц подвергают микробиологическому исследованию — определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, выявление бактерий группы кишечных палочек (БГКП), золотистого стафилококка, протея, сальмонелл.

Критерии оценки качества:

1) общая бактериальная обсеменённость. Это количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ). Высокий уровень (например, > 10⁵ - 10⁶ КОЕ/г для скоропортящихся продуктов, в сыром молоке до 1×10⁶ КОЕ/мл, в готовых кулинарных изделиях - обычно не более 1×10⁴ - 1×10⁵ КОЕ/г) указывает на: нарушение санитарных условий производства/хранения, возможность присутствия патогенов, снижение стойкости при хранении и риск порчи или пищевого отравления;

2) бактерии группы кишечной палочки (БГКП, колиформы). Этот показатель не контролируется в сыром молоке и сырых тушках птицы. Обычно устанавливается масса продукта, в которой не допускается их наличие (обычно 0,1 г, 1 г, 0,01 г);

3) патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы. Строгие требования к отсутствию сальмонелл обоснованы тем, что эти бактерии способны вызвать пищевые токсикоинфекции и инфекционные заболевания;

4) условно-патогенные микроорганизмы Нормируются либо по массе продукта, в которой не допускаются, либо по допустимому количеству КОЕ/г;

5) патогенные микроорганизмы категорически не допускаются в установленной нормативом массе продукта (обычно 25 г для сальмонелл, листерий);

6) микроорганизмы порчи, к которым относятся плесневые грибы и дрожжи, бактерии: аэробы и анаэробы и другие. Нормируются предельно допустимые уровни (КОЕ/г, мл) для: дрожжей и плесневых грибов, психротрофных бактерий (в продуктах, хранящихся при охлаждении), термоустойчивых бактерий (в пастеризованных продуктах), газообразующих микроорганизмов (в консервах, сырах);

7) возбудители паразитарных заболеваний. Категорически не допускаются. Особенно строгий контроль живых личиночных стадий опасных гельминтов в рыбе;

8) количество микроорганизмов заквасочной микрофлоры и пробиотических микроорганизмов (молочнокислые, пропионовокислые микроорганизмы, дрожжи, бифидобактерии, ацидофильные бактерии и другие).