2.1 Микробиология (всего 51 вопрос во всех профилях)

1. Классификация микроорганизмов по морфологическим, культуральным и тинкториальным признакам.

Морфологические признаки микроорганизма — это признаки, наблюдаемые непосредственно под микроскопом на живых и мертвых препаратах: форма, размеры и естественное сочетание клеток, способность к движению, спорообразованию, расположение спор в клетке, способность к образованию капсул.

По морфологическим признакам микроогранизмы подразделяются на: прокариоты, грибы (эукариоты), протисты (эукариоты) и вирусы.

Среди основных морфологических форм бактерий прокариотов (характеризуются отсутствием ядра и мембранных органелл) различают:

• шаровидные (кокковые), которые по характеру взаиморасположения делятся на:

- микрококки (отдельное изолированное расположение);

- диплококки (сцепленные попарно, например, пневмококк);

- тетракокки (сцепленные по четыре);

- стрептококки (сцепленные в цепочку);

- сарцины (сцепленные в кубические пакеты по 8, 12, 16 или больше клеток в трех плоскостях);

- стафилококки (сцепленные беспорядочно в виде виноградной грозди);

• палочковидные, которые различаются:

• по форме:

- правильная (энтеробактерии, псевдомонады);

- неправильная - клубневидная (коринебактерии).

• по размеру:

- мелкие (бруцеллы, бордетеллы);

- средние (бактероиды, кишечная палочка);

- крупные (бациллы, клостридии);

• по форме концов

- обрубленные (бациллы);

- закругленные (сальмонеллы, псевдомонады);

- заостренные (фузобактерии);

- утолщенные (коринебактерии);

• по характеру взаиморасположения все палочки делятся на:

- расположенные поодиночке;

- диплобактерии и диплобациллы (сцепленные попарно);

- стрептобактерии и стрептобациллы (сцепленные в цепочку);

- извитые формы (по характеру и количеству завитков), они делятся на:

1) вибрионы (слегка изогнутые палочки или неполные завитки обычно с одним жгутиком);

2) спириллы (один или несколько завитков и пучки жгутиков на полюсах);

3) спирохеты (гибкие, тонкие, спиралевидные клетки с множеством мелких завитков), которые в свою очередь делятся на:

а) лептоспиры (завитки с загнутыми крючкообразными концами — S-образная форма);

б) боррелии (4-12 неправильных завитков);

в) трепонемы (14-17 равномерных мелких завитков).

Нитевидные формы — клетки, образующие длинные нити, похожие на гифы грибов. Характерны для некоторых почвенных бактерий и цианобактерий.

Клетки с выростами — некоторые пресноводные бактерии имеют стебельки, почки или другие выросты.

Структуру бактерий изучают в основном с помощью электронной микроскопии (техника ультратонких срезов), дифференциального ультрацентрифугирования, цитохимических методов.

Структурные компоненты бактериальной клетки делятся на обязательные и необязательные.

Обязательными структурными компонентами являются:

• клеточная стенка,

• цитоплазматическая мембрана,

• цитоплазма с локализованными в ней рибосомами и ядерным аппаратом.

Необязательные структурные компоненты:

1) капсула (слизистый слой, окружающий клеточную стенку);

2) микрокапсула (тонкий, плотно прилегающий к клеточной стенке слизистый слой для защиты от внешних факторов, в том числе от фагоцитоза, выявляемый только иммунологическими методами или электронной микроскопией);

3) внеклеточная слизь (слизь, которую выделяют микроорганизмы биоплёнки с целью защиты клетки бактерий от опасностей окружающей среды, таких как антибиотики и высыхание, а также позволяет бактериям прилипать к гладким поверхностям);

4) включения (неживые компоненты клетки, они не обладают метаболической активностью и не ограничены мембранами. Чаще всего играют запасающую роль);

5) жгутики (органеллы движения, определяющие подвижность и влияющие на внешний вид клеток);

6) пили (нитевидные белковые структуры, расположенные на поверхности клеток многих бактерий и отвечающие за передачу генетического материала между бактериальными клетками, адаптацию организмов и участвуют в прикреплении бактерий к субстрату и другим клеткам);

7) споры (высокоустойчивые структуры для выживания в неблагоприятных условиях). Могут быть: центральными (в центре клетки), терминальными (на конце клетки), субтерминальными (ближе к концу клетки).

Грибы делятся на:

1) дрожжи. Одноклеточные грибы преимущественно сферической, овальной или эллипсоидной формы. Размножаются почкованием или делением;

2) плесневые грибы. Многоклеточные грибы, вегетативное тело (мицелий) которых состоит из системы ветвящихся трубочек (гиф). Гифы по наличию перегородок делятся на: септированные (имеют поперечные перегородки (септы), разделяющие гифу на отдельные клетки (большинство высших грибов)) и несептированные (не имеют перегородок, представляют собой одну гигантскую многоядерную клетку (например, у зигомицетов). По расположению гифы подразделяются на: воздушный мицелий (над субстратом) и субстратный мицелий (внутри субстрата);

3) диморфные грибы. Способны существовать в двух формах в зависимости от условий (часто температуры): при температуре окружающей среды (~25-30°C) растут как плесень (образуют мицелий); при температуре тела (~37°C) или в определенных питательных средах растут как дрожжи или дрожжеподобные клетки.

Протисты — разнородная группа эукариот состоящая из простейших и простых водорослей.

Простейшие (одноклеточные гетеротрофные протисты) по форме и способу движения делятся на:

1) амебоидные. Непостоянная форма тела (образуют псевдоподии - ложноножки) для движения и захвата пищи;

2) жгутиконосцы. Имеют один или несколько жгутиков для движения. Форма тела обычно постоянная;

3) инфузории. Покрыты многочисленными ресничками для движения и питания. Имеют сложную клеточную организацию с двумя типами ядер (макронуклеус и микронуклеус);

4) споровики. Как правило, внутриклеточные паразиты. Лишены специализированных органелл движения на большей части жизненного цикла. Имеют апикальный комплекс - специализированный набор органелл для проникновения в клетку хозяина. Образуют споры (ооцисты).

Микроскопические водоросли — одноклеточные, колониальные или нитевидные фотосинтезирующие протисты. Классифицируются следующим образом:

• по форме:

1) одноклеточные. Различные формы - сферические, эллипсоидные, веретеновидные, грушевидные и т.д. Могут иметь жгутики или нет;

2) колониальные. Группы клеток, объединенные слизью, часто в правильные структуры (сферические или плоские звездчатые колонии);

3) нитевидные. Клетки соединены в неразветвленные или разветвленные нити;

4) кокковидные (шаровидные без жгутиков);

5) жгутиковые;

6) пальмеллоидные. Клетки погружены в обильную слизь;

• по наличию специализированных структур: клеточная стенка (из целлюлозы, пектина, кремнезема у диатомей), панцири (у динофлагеллат), жгутики.

Вирусы. Не являются микроорганизмами в строгом смысле (не клетки).

Классификация по морфологии (типу симметрии капсида):

1) спиральная симметрия. Капсид имеет форму полого цилиндра с уложенной по спирали нуклеиновой кислотой (например, вирус табачной мозаики, вирус гриппа);

2) икосаэдрическая (кубическая) симметрия. Капсид имеет форму икосаэдра (20-гранника) (например, аденовирусы, полиовирус);

3) комплексная симметрия. Сочетание спиральной и икосаэдрической симметрии, часто с дополнительными структурами (например, бактериофаги с "головкой" (икосаэдр) и "хвостом" (спираль), вирусы оспы);

4) наличие оболочки: Вирус может быть без оболочки (только капсид) или с оболочкой (капсид + липопротеиновая оболочка - суперкапсид, полученная от мембраны клетки-хозяина). Оболочка часто имеет шипы из вирусных гликопротеинов (пепломеры).

Культуральные признаки — особенности роста бактерий на жидких (образование пленки, осадок, помутнение) и плотных (форма, размеры, консистенция, края, поверхность, прозрачность колоний, образование пигмента и другие свойства) питательных средах (или признаки, получаемые при наблюдении за развитием культуры данного микроба в различных питательных средах). По характеру культуральные признаки частично состоят из морфологических признаков (форма, цвет, блеск колонии на поверхности твердой питательной среды или в ее толще, характер краев колонии, ее строение, рост микроба в мясопептонном бульоне и пр.) и физиологических признаков (особенности питания и дыхания, отношение к температуре, характер продуктов обмена, способность свертывать молоко, разжижать желатину и пр.).

Классификация микроорганизмов по культуральным признакам основана на их внешнем виде, особенностях роста и метаболической активности на питательных средах в искусственных условиях культивирования.

Микроорганизмы по культуральным признакам классифицируются на следующие группы:

1. Бактерии и археи. Они подразделяются на группы:

• по характеру роста колоний на плотной среде:

1) по размеру: точечные (<1 мм), мелкие (1-2 мм), средние (2-4 мм), крупные (>4 мм);

2) по форме: круглые (точечные), округлые, ризоидные (корневидные, ветвящиеся), нитевидные, неправильные, амебоидные, в форме запятой;

3) по виду края бактерии: ровный (гладкий), волнистый, лопастной, зазубренный, бахромчатый, филаментозный (нитевидный), курчавый;

4) по виду поверхности: гладкая (S-форма), шероховатая (R-форма), слизистая (M-форма), складчатая, морщинистая, бородавчатая, матовая, блестящая (глянцевая), сухая, влажная;

5) по профилю выпуклости: плоские, приподнятые, выпуклые, куполообразные, пуговчатые, кратерообразные, каплевидные;

6) по структуре: гомогенные, зернистые, волокнистые, ватообразные (у актиномицетов);

7) по цвету: бесцветные (сероватые), белые, желтые, оранжевые, красные, розовые, зеленые, синие, фиолетовые, черные;

8) по виду пигментации: водорастворимый пигмент (диффундирует в среду) и нерастворимый пигмент (остается в колонии);

9) по консистенции: маслянистые, пастообразные, вязкие (слизистые), хрупкие, сухие, крошащиеся;

10) по оптическим свойствам: прозрачные, полупрозрачные, непрозрачные. Блестящие или матовые;

11) по запаху: специфические запахи (например, фруктовый у Pseudomonas aeruginosa, запах земли у Streptomyces, запах прогорклого масла у Clostridium);

12) по виду гемолиза на кровяном агаре: бета-гемолиз - полное разрушение эритроцитов - четкая прозрачная зона вокруг колонии, альфа-гемолиз - частичное разрушение эритроцитов - зона зеленоватого или коричневатого обесцвечивания вокруг колонии, гамма-гемолиз - отсутствие гемолиза - изменений вокруг колонии нет;

• по характеру роста в жидкой среде:

1) равномерное помутнение - многие бактерии;

2) придонный рост - осадок на дне, бульон может быть прозрачным или мутным;

3) пристеночное кольцо или плёнка на поверхности - пленка (часто сухая, морщинистая) или кольцо на стенке пробирки у поверхностно растущих бактерий;

4) хлопьевидный рост - образование хлопьев или комков в толще среды или на дне;

5) зернистый рост;

6) цвет - изменение цвета среды из-за пигмента или продуктов метаболизма;

2. Грибы. Они подразделяются на группы:

по скорости роста:

1) быстрорастущие (1-3 дня);

2) умереннорастущие (3-7 дней);

3) медленнорастущие (>7 дней);

по виду колонии на плотной среде:

1) дрожжи. Часто гладкие, выпуклые, блестящие, сливкообразные колонии, похожие на бактериальные. Цвет белый, кремовый, розовый, красный или чёрный. Консистенция маслянистая, пастообразная или слизистая;

2) плесневые грибы. По текстуре мицелия бывают: войлочные (рыхлые), паутинистые (тонкие, нитевидные, паутинообразные), порошковатые (обильное спороношение, похоже на порошок), зернистые (комковатые, зернистые), велветовые (бархатистые, однородные), кожистые (плотные, кожистые). Цвет мицелия: белый, серый, жёлтый, коричневый, оранжевый или чёрный. Цвет спороношения: дымчато-серый, серо-зеленый, чёрный, жёлто-зелёный, голубовато-зелёный, серо-зелёный, розовый, фиолетовый, белый. Запах отсутствует или дрожжевой, фруктовый, землистый, затхлый, аммиачный;

3. Простейшие. Культивирование сложнее и требуется не всегда для рутинной диагностики. Используются специальные среды, часто содержащие клетки тканей, сыворотку, эритроциты.

Многие простейшие (особенно амебы, жгутиконосцы) на плотных средах образуют колонии, похожие на бактериальные (округлые, слизистые), но обычно крупнее и с менее четкими границами.

В жидких средах происходит помутнение, образование осадка, пристеночного кольца. Активное движение можно наблюдать под микроскопом.

4. Микроскопические водоросли. Культивируются на специальных средах (часто жидких) для аквакультуры или исследований.

В жидкой среде происходит окрашивание среды в цвет пигмента (зеленый, диатомовый - бурый, красный).

На плотной среде происходит образование колоний разного цвета (зеленые, желто-зеленые, бурые, красные), формы и консистенции (слизистые).

5. Вирусы. Их особенностью является то, что они не культивируются на бесклеточных средах, а требуют живых клеток-хозяев (культуры клеток, куриные эмбрионы, лабораторные животные).

При их внедрении в клетки происходят следующие видимые под микроскопом изменения в клеточном монослое, вызванные вирусной инфекцией:

1) округление и отслоение клеток (энтеровирусы);

2) слияние клеток с образованием синцития (гигантских многоядерных клеток) (вирус кори, герпеса, респираторно-синцитиальный вирус);

3) грануляции в цитоплазме или ядре (аденовирусы);

4) образование телец-включений (цитомегаловирус, вирус бешенства, вирус оспы);

5) полная деструкция (лизис) монослоя.

Тинкториальные признаки — способность окрашиваться различными красителями (воспринимать и удерживать красители). Особенно важным признаком является отношение к окраске по Граму, которое зависит от структуры и химического состава клеточной стенки бактерий. По этому признаку все бактерии делятся на грамположительные и грамотрицательные. Это ключевой метод в микробиологической диагностике, особенно для бактерий, так как он позволяет визуализировать структуры клетки и дифференцировать микроорганизмы по составу клеточной стенки и другим особенностям.

Основные методы окраски и выявляемые ими группы прокариотических микроорганизмов:

1) простая окраска. Использование одного основного красителя (чаще всего щелочного: метиленовый синий, генциановый фиолетовый, фуксин основной). Цель: выявление общей формы, размеров, расположения клеток и некоторых включений. Не дает дифференцирующей информации;

2) окраска по Граму. Многоступенчатый метод (основной краситель → протрава → обесцвечиватель → дополнительный краситель). Основан на различиях в строении клеточной стенки.

Используя данный метод окрашивания выявляются следующие группы микроорганизмов:

• грамположительные бактерии. Окрашиваются фиолетовым или синим цветом из-за наличия толстого многослойного пептидогликана в клеточной стенке и отсутствия наружной мембраны. Спирт вызывает дегидратацию пептидогликана, поры сужаются, комплекс не вымывается. Примеры: Роды Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Bacillus, Clostridium, Listeria, Corynebacterium, Mycobacterium, Actinomyces, молочнокислые бактерии;

• грамотрицательные бактерии. Окрашиваются розовым/красным (после обесцвечивания спиртом/ацетоном воспринимают дополнительный краситель - фуксин или сафранин) по причине наличия тонкого слоя пептидогликана и наличия наружной липополисахаридной (ЛПС) мембраны. Обесцвечиватель растворяет липиды наружной мембраны, комплекс генцианвиолет-йод вымывается из тонкого пептидогликана;

3) окраска на кислотоустойчивость. Способность некоторых бактерий удерживать основной краситель (карболовый фуксин) даже после обработки сильным кислотным обесцвечивателем (серной кислотой или HCl-спиртом). Основана на высоком содержании миколовых кислот и липидов в клеточной стенке.

Используя данный метод окрашивания выявляются следующие группы микроорганизмов:

• кислотоустойчивые бактерии. Окрашиваются в ярко-красный цвет или флуоресцируют;

• некислотоустойчивые бактерии. Окрашиваются синим или зелёным (дополнительным красителем, обычно метиленовым синим или малахитовым зелёным);

4) окраска капсул. Капсула обычно не окрашивается стандартными методами, так как состоит из гидрофильных полисахаридов или полипептидов. Используются методы, создающие негативное контрастирование (окрашивается фон, капсула остается бесцветной) или специальные красители. Основные методы окрашивания: окраска по Бурри-Гинсу (тушь), по Хиссу (медный купорос и фуксин).

Используя данный метод окрашивания выявляются следующие группы микроорганизмов:

• капсулообразующие микроорганизмы. Окружены бесцветным (на негативном фоне) или окрашенным (в зависимости от метода) гало;

5) окраска жгутиков. Жгутики очень тонкие. Используются методы, осаждающие на них краситель или протраву, увеличивая их диаметр и делая видимыми в световой микроскоп (часто после длительной фиксации и протравливания). Используются следующие методы окраски: окраска по Леффлеру, по Грею, по Рю.

Используя данный метод окрашивания выявляются следующие группы микроорганизмов:

• жгутиковые (подвижные) бактерии. Видны тонкие нитевидные структуры (жгутики), отходящие от клетки. Расположение жгутиков (монотрихи, лофотрихи, амфитрихи, перитрихи) является важным диагностическим признаком;

6) окраска эндоспор. Зрелые эндоспоры плохо воспринимают стандартные красители из-за плотной многослойной оболочки. Используются методы с нагреванием (для проникновения красителя) и обесцвечиванием (вымывание красителя из вегетативной клетки). Используются следующие методы окраски: окраска по Ожешко (модификация Циля-Нильсена), по Шефферу-Фултону (малахитовый зеленый).

Используя данный метод окрашивания выявляются следующие группы микроорганизмов:

• спорообразующие бактерии. Споры окрашиваются в ярко-красный (фуксин) или зеленый (малахитовый зеленый) цвет, вегетативные клетки - в контрастный цвет (синий/красный). Важно положение и форма споры (центральная, терминальная, субтерминальная; деформирует клетку или нет).

7) окраска по Нейссеру. Выявление гранул полиметафосфата (волютина), характерных для некоторых бактерий.

Используя данный метод окрашивания выявляются следующие группы микроорганизмов:

• бактерии с волютиновыми включениями. Зерна окрашиваются в тёмно-синий или чёрный цвет, тело клетки - в жёлто-коричневый.

Окраски для эукариотических микроорганизмов:

1) грибы. Используются следующие красящие компоненты:

• лактофенол хлопковый синий. Стандарт для микроскопии плесеней. Окрашивает хитин клеточных стенок в синий цвет, делает видимыми перегородки, спорангии, конидии. Не окрашивает цитоплазму;

• калькофлуор белый. Флуоресцентный краситель, связывающийся с хитином и целлюлозой клеточной стенки грибов. Грибы светятся ярко-голубым или зеленым под УФ-светом. Очень чувствительный метод;

• периодический кислотный Шифф. Окрашивает полисахариды (гликоген, мукополисахариды) в клеточных стенках грибов и некоторых капсул в малиново-красный цвет. Широко используется в гистопатологии;

• грамо-подобные окраски. Некоторые дрожжи могут окрашиваться по Граму (обычно Gr+), но метод не является основным для их дифференцировки;

• окраска тушью. Выявление капсулы у дрожжей;

2) простейшие. Используются следующие красящие компоненты:

• гематоксилин-эозин. Стандартная гистологическая окраска. Ядра - сине-фиолетовые, цитоплазма - розовая. Позволяет увидеть общую структуру;

• трихром. Специфическая окраска для кишечных простейших (микроспоридии). Окрашивает ядра, цитоплазму, органеллы в разные контрастные цвета;

• йод (раствор Люголя). Для временных препаратов. Окрашивает гликогеновые вакуоли (коричнево-желтые), делает видимыми ядра и жгутики;

• гимза. Широкого спектра. Окрашивает ядра в красно-фиолетовый, цитоплазму в голубой. Используется для крови (малярийные плазмодии, трипаносомы, лейшмании), а также для некоторых внутриклеточных простейших.

Окраски для вирусов (не окрашиваются стандартными бактериологическими красителями из-за отсутствия собственных метаболических структур и малых размеров):

1) иммунофлуоресцентное окрашивание. Используются специфические антитела, меченные флуорохромом, для выявления вирусных антигенов внутри инфицированных клеток или в клинических образцах. Вирусные антигены светятся под флуоресцентным микроскопом;

2) гистохимические окраски. В гистологических срезах инфицированных тканей могут выявляться вирусные тельца-включения с помощью специальных окрасок (например, по Манну, по Гимзе).