Методичка - биология в рисунках и схемах

90. (26) Экспериментальные доказательства генетической роли нуклеиновых кислот. Трансформация. Проиллюстрируйте ответ

Трансформация – направленный перенос и встраивание в генетический аппарат клетки небольшого фрагмента чужеродной ДНК. Посредством генетической рекомбинации часть трансформирующей молекулы ДНК может обмениваться с частью хромосомной ДНК донора. Известно, что бактерия Pneumococcus pneumonie имеет несколько форм. Вирулентность ее определяется наличием мукополисахаридной капсулы на поверхности клетки, которая защищает бактерию от воздействия со стороны организма – хозяина. (Капсула – слой полипептидов или полисахаридов, липидов или гетерополисахаридов и до 90% воды, расположенных поверх клеточной стенки и выполняющий функции осмотического барьера, защиты от высыхания и механических повреждений.) В результате размножившиеся бактерии убивают зараженное животное. Бактерии этого штамма (S- штамм) образуют гладкие колонии. Авирулентные формы не имеют защитной капсулы и образуют шероховатые колонии (R-штамм). Микробиолог Ф. Гриффитс в 1928 году инъецировал мышам культуру живого пневмококка R-штамма вместе с S-штаммом, убитым высокой температурой равной 65 градусов Цельсия. (см. рисунок).

Спустя некоторое время ему удалось выделить из зараженных мышей живые пневмококки, обладающие капсулой. Таким образом, оказалось, что свойство убитого пневмококка – способность образовывать капсулы

– перешло к живой бактерии, то есть, произошла трансформация этих клеток. От этого превращения клеток и возник сам этот термин. Поскольку признак наличия капсулы является наследственным, то следовало предположить, что какая-то часть наследственного вещества от бактерий штамма – S перешла к клеткам штамма – R. Таким образом, стало ясно, что от одного штамма бактерий к другому возможна передача наследственного начала, однако химическая природа его не была обнаружена. Химическая природа вещества, трансформирующего наследсвенные свойства бактерия, была установлена лишь в 1944 году О. Эйвери., доказавшим его принадлежность к нуклеиновым кислотам (ДНК).

Трансформация - приобретение новых характеристик под влиянием введения чужеродного ДНК

S(smooth) - капсула, вирулентный

R(rough) - без капсулы, не вирулентный

Пневмококки вводились мышам:

1.Живые клетки R II штамма - мыши здоровы

2.Живые клетки S III штамма - мыши погибали

3.Инактивные нагреванием клетки S III штамма - мыши выживали

4.Смесь живых R II и инактивированных S III клеток - мыши погибают, т.к. происходила трансформация. R II в S III. Трансформирующим фактором является ДНК S II штамма, которая не разрушилась при нагревании.

91. (26) Экспериментальные доказательства генетической роли нуклеиновых кислот. Трансформация. Расшифруйте схему

Трансформация – направленный перенос и встраивание в генетический аппарат клетки небольшого фрагмента чужеродной ДНК. Посредством генетической рекомбинации часть трансформирующей молекулы ДНК может обмениваться с частью хромосомной ДНК донора. Известно, что бактерия Pneumococcus pneumonie имеет несколько форм. Вирулентность ее определяется наличием мукополисахаридной капсулы на поверхности клетки, которая защищает бактерию от воздействия со стороны организма – хозяина. (Капсула – слой полипептидов или полисахаридов, липидов или гетерополисахаридов и до 90% воды, расположенных поверх клеточной стенки и выполняющий функции осмотического барьера, защиты от высыхания и механических повреждений.) В результате размножившиеся бактерии убивают зараженное животное. Бактерии этого штамма (S- штамм) образуют гладкие колонии. Авирулентные формы не имеют защитной капсулы и образуют шероховатые колонии (R-штамм). Микробиолог Ф. Гриффитс в 1928 году инъецировал мышам культуру живого пневмококка R-штамма вместе с S-штаммом, убитым высокой температурой равной 65 градусов Цельсия. (см. рисунок).

Спустя некоторое время ему удалось выделить из зараженных мышей живые пневмококки, обладающие капсулой. Таким образом, оказалось, что свойство убитого пневмококка – способность образовывать капсулы

– перешло к живой бактерии, то есть, произошла трансформация этих клеток. От этого превращения клеток и возник сам этот термин. Поскольку признак наличия капсулы является наследственным, то следовало предположить, что какая-то часть наследственного вещества от бактерий штамма – S перешла к клеткам штамма – R. Таким образом, стало ясно, что от одного штамма бактерий к другому возможна передача наследственного начала, однако химическая природа его не была обнаружена. Химическая природа вещества, трансформирующего наследсвенные свойства бактерия, была установлена лишь в 1944 году О. Эйвери., доказавшим его принадлежность к нуклеиновым кислотам (ДНК).

Трансформация - приобретение новых характеристик под влиянием введения чужеродного ДНК

S(smooth) - капсула,

вирулентный

R(rough) - без кап-

сулы, не вирулентный Пневмококки вводи-

лись мышам:

1.Живые клетки R II штамма - мыши здоровы

2.Живые клетки S III штамма - мыши погибали

3.Инактивные нагрева-

нием клетки S III штамма - мыши выживали

4.Смесь живых R II и инактивированных S III клеток - мыши погибают, т.к. происходила трансформация. R II в S III. Трансформирующим фактором является ДНК S II штамма, которая не разрушилась при нагревании.

92. (27) Экспериментальные доказательства генетической роли нуклеиновых кислот. Трансдукция. Расшифруйте схему

Для бактерий нужен триптофан для роста, у нас есть два вида бактерий, у одних есть триптофан, у других нет. Между ними мембрана, через нее пройти бактерии не могут, но могут пройти вирусы, они поражают бактерии с триптофаном, переходят через мембрану и переносят часть генетической информации к бактериям без триптофана

Сущность свления трансдукции и способ его открытия состоит в следующем. U-образная труюка в нижней части была разделена бактериальным фильтром. В одну половину этой трубки были помещены бактерии мышиного тифа штамма 22А, а в другую половину трубки штамма 2А., лизогенную по фагу. При этом бактериальные клетки не могли переходить сквозь

перегородку. Штамм 22А нес мутацию, тормозящую синтез трипотофана, и поэтому культивированные бактерии нуждались в добавке триптофана в среду. Штамм бактерии 2А синтезировал триптофан, поэтому не нуждался в нем при культивировании. После инкубации этих двух штаммов в трубке, разделенной только бактериальным фильтром, был произведен рассев клеток обоих штаммов. При рассеве клеток штамма 22А на среде, лишенной триптофана, было обнаружено небольшое число колоний. Следовательно, некоторые клетки штамма 22А каким-то образом приобрели способность синтезировать триптофан и смогли дать колонии на среде без этой аминокилосты.

Фаг, вышедший из бактериальных клеток штамма 2А, проник через фильтр, внедрился в некоторые клетки штамма 22А и передал им часть наследвенной информации-фрагмент наследственного материала штамма 2а. Явление переноса бактериофагом наследственной информации от одних бактерий другим-новая форма рекомбинации генов-получило название трансдкукции.

Механизм этого явления заключается в том, что трансдуцирующий бактериофаг при размножении в клетках хозяина захватывает часть его генетического материала и переносит во вновь зараженные клетки. Фаг может переносить самые различные гены бактерий.

93. Теломеразная теория старения

Теломеразная теория

Укорачивание теломер при делении клеток. Гениальная гипотеза 70-е годы.

-Нeполное воспроизводство ДНК при каждом клеточном цикле

Клетки новорожденных делятся 70-80 раз, 70-летнего человека - 20-30 раз.

Всреднем клепси человека могут делиться 50-59 раз “Лимит Хейфлика”

Затем резко нарушаются процессы воспроизводства ДНК, клетки «дряхлеют» и погибают

Теломерные участки хромосом представлены высококонсервативными множественными повторами. У человека кол-во этих блоков нуклеотидов от 2 до 20 тыс. нуклеотидов, при каждом делении кол-во этих блоков сокращается, до определенного предела это не опасно. Есть предел, за границей которого дальнейшее укорочение теломерных участков нарушает их функцию - это приводит к резкому старению и гибели клетки.

В зародышевых и стволовых клетках - механизм «омоложения» теломер при каждом делении происходит восстановление недосинтезированного участка - фермент (комплекс) теломераза.

Максимальная активность теломеразы в половых клетках, в соматических клетках активность теломеразы полностью отсутствует. В опухолевых клетках вторично появляется теломеразная активность. С одной стороны увеличение теломеразной активности замедлило бы старение, но с другой стороны увеличивался бы риск онкозаболеваний.

Апоптоз -это физиологический механизм запрограммированной гибели клеток При старении изменяется характер работы 1%-2% генов. В результате происходит накопление поломок в клетке, страдает энергоснабже-

ние клетки.

Апоптоз - это харакири клетки

ВЫВОД: Ключевой механизм старения сокращение теломерных участков хромосом Олег и Яна

При каждом делении теломеры недореплицируются. Фермент теломераза способен достраивать теломеры, но он активен только в эмбриональных стволовых или раковых клетках, а в соматических подавлен

94. Теории старения. Свобднорадикальная. Митохондриальная

Свободно-радикальная теория Д.Хармана (1956) и Н.М.Эмануэля (1958)

(С возрастом увеличивается кол-во свободных радикалов с возрастом (атеросклероз, б-нь Альцгеймера), снижается антирадикальная защита.

Своб радикалы вызывают:

окислит-е поврежд-е макромолекул, в том числе ДНК → Поврежденные ДНК могут играть роль в мутагенезе в старости.

Молодой орг-м защищён от токсического воздействия свободных радикалов многоуровневой системой

антиоксидантов:

Антиоксиданты первичной защиты (мочевая к-та, витамин Е) ослабевают реакцию образования свободных радикалов.

Антиоксиданты вторичной защиты улавливают, т.е. нейтрализуют уже образовавшиеся свободные радикалы.

95. (8) Понятие о генной инженерии. Использование вирусов в качестве векторов

Генная инженерия ‒ это раздел молекул-й биологии, прикладная молекул генетика, задачей к-й явл целе- направл-е конструиров-е новых, не существующих в природе сочетаний генов при помощи генетич-х и биохи- мич-х методов.

Схема генной коррекции

1.Создание генетической конструкции. Векторная система: вирус, лишенный патогенного потенциала.

2.Методы введение генетической конструкции:

·физический(микроиньекция)

·химическая(соли некоторых элементов, например Ca)

·биологическая(вирусные векторы)

3.Оценка эффективности на биологических моделях

4.Клинические испытания

Современные проблемы генной инженерии

Генная инженерия - это раздел молекул-й биологии, прикладная молекул генетика, задачей к-й явл целена- правл-е конструиров-е новых, не существующих в природе сочетаний генов при помощи генетич-х и био- химич-х методов. Этич и религиозн аспекты.

Проблемами могут быть:

-новые комбинации генов могут блокироваться белками-репрессорами -белки, которые синтезируются новыми генами, могут распознаваться организмом, как чужеродные.

-организмы с генными преобразованиями (манипуляциями) менее жизнеспособны -не известно, как поведут себя эти новые гены в других поколениях

96. Обратная транскрипция и ее использования в генной инженерии

Синтез ДНК при использовании в качестве матрицы РНК носит название обратной транскрипции. Данный процесс катализирует фермент об-

ратная транскриптаза или ревертаза. Существование обратных тран-

скриптаз в составе РНК-содержащих вирусов было показано Г.Темином и Д. Балтимором. Обнаружение обратной транскриптазы позволило ответить на вопрос: как генетическая информация РНК-содержащих вирусов может включиться в ДНК клетки-хозяина. Процесс обратной транскрипции, катализируемый ревертазой, и последующая интеграция генетического материала в геном клетки хозяина представлены на рис. 51. В процессе обратной транскрипции вначале образуется дуплекс РНК – ДНК, затем РНК в составе этого дуплекса разрушается, синтезированная цепь ДНК далее служит матрицей для синтеза второй цепи ДНК. На заключительной стадии происходит интеграция ДНК, синтезированной в резуль-

тате обратной транскрипции, в ДНК клетки-хозяина. Обратные транскриптазы способны синтезировать ДНК, комплементарную самым различным РНК. Благодаря этой особенности ревертаза нашла широкое применение в научных исследованиях. С помощью обратной транскриптазы можно получить, например, искусственный

ген, используя в качестве матрицы иРНК.

В генетической инженерии обратную транскриптазу используют для получения кДНК — копии эукариотического гена, не содержащей интронов. Для этого из организма выделяют зрелую мРНК (кодирующую соответствующий генный продукт: белок, РНК) и проводят с ней в качестве матрицы обратную транскрипцию. Полученную кДНК

можно трансформировать в клетки бактерий для получения трансгенного продукта

Техника генной инженерии включает несколько последовательных процедур:

·выделение нужного (целевого) гена;

·встраивание его в генетический элемент, способный к репликации (вектор); · введение вектора в организмреципиент;

·идентификация (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены.

97.Понятие об альтернативном сплайсинге. Прокомментируйте схемы

Один ген может служить матрицей для неск-х различных белков, если происход альтернативный сплайсинг, т.е. в кач-ве интронов вырез-ся разн уч-ки мол-лы пре-иРНК. Альтернативный сплайсинг – из одного первого РНК-транскрипта в разных тканях образуется несколько разных по длине зрелых иРНК. Таким образом, альтернативный сплайсинг позволяет увеличить разнообразие белковых продуктов генов, не увеличивая пропорционально этому размер генома, в том числе, не создавая дополнительных копий генов. Биологический смысл альтернативного сплайсинга для многоклеточных эукариот состоит в том, что он, по-видимому, является ключевым механизмом увеличения разнообразия белков, а также позволяет осуществлять сложную систему регуляции экспрессии генов, в том числе тканеспецифической.

Альтернативный сплайсинг или дифференциальный сплайсинг , является регулируемым процессом во время экспрессии генов , что приводит к одному гена , кодирующего нескольких белков . В этом процессе, конкретные экзоны гена могут быть включены в или исключены из окончательного, обработанного матричной РНК (мРНК) получают из этого гена. Следовательно, белки , переведенные из альтернативного сплайсинга мРНК будет содержать различия в их аминокислотной последовательности и, часто, в своих биологических функций (см рисунок). Следует отметить, что альтернативный сплайсинг позволяет геном человека направить синтез белков многих больше, чем можно было бы ожидать от его 20000 белок-кодирующих генов.

Альтернативный сплайсинг происходит как нормальное явление в эукариот , где она значительно повышает биологическое разнообразие белков , которые могут быть закодированы в геноме; у людей, ~ 95% мульти-exonic генов альтернативный сплайсинга. Есть многочисленные способы альтернативного сплайсинга наблюдаемому, из которых наиболее распространенным является пропуск экзонов . В этом режиме, конкретный экзон может быть включен в мРНКе при некоторых условиях или в конкретных тканях, и исключен из мРНКа в других.

Производство альтернативного сплайсинга мРНК регулируется системой транс-действующие белки , которые связываются с цис-действующие сайты в первичных транскриптов самой. Такие белки включают сплайсинг активаторы, которые способствуют использованию конкретного сайта сплайсинга, а также сплайсингу репрессоры, которые уменьшают использование определенного сайта. Механизмы альтернативного сплайсинга весьма разнообразны, и новые примеры постоянно найдены, в частности, за счет использования методов с высокой пропускной способностью. Исследователи надеются, что в полной мере осветить регуляторные системы, вовлеченные в сплайсинге, так что альтернативный сплайсинг продукты из данного гена в конкретных

условиях («варианты сплайсинга») могут быть предсказаны «сращивания кода».

Аномальные вариации в сплайсинге, также причастны к болезни ; большая часть человеческих генетических нарушений в результате вариантов сплайсинга. Аномальные варианты сплайсинга также полагает, способствует развитию рака, и гены фактора сплайсинга часто мутирует в различных типах рака.

98. Современные методы редактирования генома (CRISPR/CAS9 и др.)

Генная терапия для лечения онкологических заболеваний крови

Повторы в геноме бактерий.

CRISPR - короткие прямые повторы, регулярно расположенные группами, между повторами располагаются уникальные последовательности примерно той же длины - спейсеры.

CRISPR-структуры были найдены у 45% всех известных бактерий и 85% архей. В геномах эукариот и вирусов ничего подобного обнаружено не было.

Впервые были описаны в 1987 г. в геноме кишечной палочки (Escherichia coli)

Число составных звеньев CRISPR-кассете может варьировать от двух до нескольких сотен Часто в геномах встречается более одной кассеты.

CRISPR-структуры чаще располагаются на основной хромосоме (нуклеоиде), но иногда входят в состав плазмид (маленьких кольцевых, автономно редуцирующихся)

Участки последовательности в начале и в конце повтора обратно комплементарны - могут образовывать устойчивые вторичные структуры, прежде всего шпильки

Иммунная система бактерий

в 2005 г проанализировали спейсеры уже известных кассет у бактерий. Сравнили спейсеры со всеми известными последовательностями ДНК. Оказалось, что спейсеры CRISPR-кассет часто совпадают с участками генов бактериофагов (вирусов бактерий), специфичных для этих бактерий.

cas-гены - сцепленные с CRISPR-кассетами cas - гены кодируют целое семейство белков cas1 - белок нарезает ДНК на фрагменты cas 2 - расщепляет молекулы РНК

cas 3 - относится к геликазам (расплетает ДНК)

cas 4 - экзонуклеаза, отщепляющая концевые нуклеотиды ДНК и РНК

CRISPR защищает прокариот от вирусов из плазмид. Включение участков геномов мобильных элементов в виде спейсеров - не что иное, как иммунная память, которая может передаваться.

CRISPR/Cas-система - иммунная система бактерий.

CRISPR-кассета - это история болезней бактерии, а спейсеры соответствуют записям об отдельных инфекциях.

1.Вирус умеет “убивать” от CRISPR-иммунитета, накапливая точечные мутации.

2.Адаптация, или приобретение новых спейсеров. Работают белки cas1 и cas2, вырезают и вставляют новый спейсер.

3.Состоит из РНК и белков Cas. Создание Cascade коплекса

4.Иммунный ответ, т.к. разрушение чужеродной ДНК. РНК узнает вирусную РНК/ДНК, а эндонуклеазы Cas её режут.

Редактирование ДНК - CRISPR/Cas-система

Технология CRISPR основана на направленном редактировании генома с помощью эндонуклеазы.

1-2. Cas9 формирует комплекс с РНК, РНКкомплементарна нужной последовательности. Комплекс связывается с ДНК.

3.Фермент Cas9 совершает двунитевые разрезы в нужных участках гена, удаляя дефекты в ДНК/РНК

4.После того как разрыв внесен, включаются системы восстановления ДНК, и нужная неповрежденная последовательность, втсает на место удаленной дефектной.

99. Эпигеномная изменчивость. Химическая модификация ДНК. Прокомментируйте схему

B - ментилированные гистоны (когда уровень метилир гистонов высокий выше укомпактовка хроматина и как следствие ниже эксперессия). ниже у тебя гистоны ацетилированные, когда гистоны ацетилированны хроматин менее компактен и экспрессия возможна

A - метилирование днк в особом положении, с метилир днк связываются специализир белки готовые привлекают в эту часть генома деацетилазы, которые будут осущевствлять деацетилирование гистонов (+ другие белки ремоделирующие хроматин)

ии как следствие большую компактизацию хроматина и падение экспрессии.

Исследователями были созданы уникальные трансгенные миши, названные агути, так как в их геном был интегрирован одноименный ген, дающий животным не только желтую окраску и лишний вес, но и предрасположенность к раку и диабету. В обычных условиях эти мыши приносят такое же потомство, тучное, желтое и болезненное, но ученые смогли сделать так, что потомство вдруг начало рождаться здоровым, имело нормальную окраску и жило долго. Эффект гена агути был полностью стерт, хотя ни один нуклеотид ДНК мыши не был изменен.

Ученые посадили будущих мам на диету, обогащенную веществами с метильной группой (один атом углерода соединен с тремя атомами водорода). Таких метильных групп много в овощах и фруктах, например в луке, чесноке и свекле. Эмбрионы мышей, которые были на такой диете, выключали ген агути у себя на хромосомах. Другими словами, чем больше метильных групп поступало с пищей и вовлекалось в питание зародышей, тем больше они были доступны для специальных ферментов, катализирующих присоединение метильной группы к ДНК. Рэнди Джиртл так прокомментировал свое открытие журналу Discover в статье «ДНК это не судьба»: «Эпигенетика доказывает, что мы ответственны за целостность нашего генома. Раньше мы думали, что только гены предопределяют, кто мы. Сегодня мы точно знаем: все, что мы делаем, все, что мы едим, пьем или курим, оказывает воздействие на экспрессию наших генов и генов будущих генераций. Эпигенетика предлагает нам новую концепцию свободного выбора» Исследователи наблюдали за поведением крыс во время воспитания потомства. Они подметили, что новорожденные крысята, которые регулярно получали надлежащую материнскую опеку, росли достаточно смелыми и спокойными по характеру. Напротив, малыши, которых матери игнорировали во время воспитания, вырастали боязливыми и нервными. Причины этого, как оказалось, были чисто эпигенетическими: обычная забота матерей о потомстве контролировала уровень метилирования именно тех генов мозга детенышей, которые отвечают за реакцию на стресс рецепторов гормона кортизола, экспрессируемых в гиппокампе.

Химическая модификация ДНК

Химическая модификация ДНК - метод локализации структурных переходов , основанный на химической модификации ДНК в местах образования неканонических структур , внесении разрывов по местам модификации и последующем определении местоположения этих разрывов. Этот метод основан на использовании химических реагентов, которые модифицируют основания ДНК по тем местам, которые в регулярной В- форме экранированы структурой двойной спирали. Дальнейшая химическая обработка такой избирательно модифицированной ДНК приводит к расщеплению сахаро-фосфатных цепей в местах первичной модификации. В качестве первичных модифицирующих агентов используются такие соединения, как диэтилпирокарбонат, модифицирующий неспаренные пурины, диметилсульфат, взаимодействующий с гуанинами, у которых незащищена позиция N7, четырехокись осмия, модифицирующая неспаренные тимины, и некоторые другие.

В случае крестообразных структур модификация прежде всего происходит в петлях шпилек крестов . Для участков ДНК, находящихся в левоспиральной Z-форме , картина модификации зависит от типа химического агента и от последовательности оснований в этом участке. Так, для участка с регулярной последовательностью d(GC)n, перешедшего в Z-форму, диэтилпирокарбонат взаимодействует со всеми гуанинами этого участка, а гидроксиламин лишь с цитозинами, расположенным на стыках B- и Z-форм. Более сложная картина наблюдается для нерегулярных последовательностей, находящихся в Z-форме. Очень эффективным оказался метод химической модификации и для установления структуры H-формы ДНК.