Пособие ENG (Бердженхолц) - эндодонтология

на участке обнажения, несмотря на употребление гру­ бой пищи. В подтверждение полученных данных асеп­ тически девитализированные пульпы, изолированные и сохранённые стерильными в течение 6-7 мес в тканях экспериментальных обезьян, не вызвали воспалитель­ ных реакций апикальных тканей. Напротив, пульпы, фрагментированные инструментами и контаминированные бактериями полости рта, вызвали клинические, рентгенологические и гистологические симптомы апи­ кального периодонтита [42].

Связь апикального периодонтита с наличием бак­ терий в корневых каналах доказали многочисленные исследования облигатных анаэробов, входящих в состав микробиоты каналов зубов человека. В этих исследова­ ниях [6, 43, 63] были получены образцы бактериаль­ ных культур из тканей пульпы, некротизированных вследствие травмы. Забор производили в строго асеп­ тических условиях. Было чётко подтверждено, что при отсутствии бактериального роста нет рентгенографи­ ческих симптомов апикального воспаления, в то время как в большинстве случаев с явным поражением проис­ ходил бактериальный рост.

Пути проникновения микроорганизмбов в пульпов/ю камеру

Корневые каналы зубов обычно стерильны, наличие микроорганизмов напрямую связано с инвазией. Пока пульпа жизнеспособна и имеет функционирующую

и содержимого полости рта (см. главу 2). С другой стороны, при глубоком кариозном поражении массив­ ное проникновение бактерий преодолевает защитный воспалительный барьер, позволяя бактериям колони­ зировать пульповую камеру. Подобный путь инвазии встречается в зубах с обнажением тканей пульпы вследствие травмы, перелома, трещины и ятрогенного

канала присутствуют в зубах с заболеваниями пародонта. Бактерии поддесневой бляшки могут проникнуть через дополнительные латеральные и фуркационные канальцы. В тяжёлых случаях, при серьёзном разруше­ нии периодонтальных тканей возможно проникнове­ ние через апикальное отверстие.

Как бы то ни было, прямой путь из внешней среды не обязательно становится предпосылкой для микроб­ ной колонизации пульповой камеры. При поврежде­ нии пульпы микроорганизмы из полости рта могут проникнуть вдоль дентинных канальцев после их обнажения из-за травмы, резорбции корня, кариеса

(см. главу 15), микроорганизмы могут пересечь барьер твёрдой ткани [6, 63]. Фактически внедрение также возможно через незначительные трещины в эмали и дентине, которые возникают при травме [34]. В таких

через кровоток. Известно, что у людей распространена бактерие^м (см. главу 8), но микроорганизмы обычно удаляются из кровеносного русла, и сомнительно пред­ положение, что бактерии из других отделов организма можно обнаружить в повреждённых зубах. Таким обра­ зом, теряется значение анахореза как вероятного пути проникновения в ткани некротизированной пульпы. На рис. 6.1 проиллюстрированы наиболее частые пути поступления микроорганизмов полости рта в корневой канал в случае некроза пульпы.

Способы микробного колониеобразования

всвободном взвешенном состоянии, в виде одной

клетки (планктонная форма) или присоединёнными друг к другу, в том числе на стенках корневого канала. Микроорганизмы, пребывающие в планктонной форме, требуют наличия жидкости. Жидкость в корневых кана­ лах - прежде всего воспалительный экссудат, который высвобождается на поверхности защитного антибакте­ риального барьера. При наличии сообщения системы корневого канала с содержимым полости рта слюна также может участвовать в переносе микроорганизмов.

Когда плотность бактериальных клеток увеличи­ вается и они встраиваются во внеклеточный матрикс полимеров местного и микробного генеза, образуется микробная биоплёнка. Бактерии, представленные в таких

чая патологические процессы корневых каналов, часто вызваны (в том числе) и микроорганизмами биоплёнки. В то время как планктонные микроорганизмы легко устранить, существует серьёзная необходимость в тера­ пии состояний, вызванных прикреплёнными к стенкам микроорганизмами корневого канала. Это особенно важно при наличии микроорганизмов во всех отделах просвета корневого канала, в том числе и в дентинных канальцах (рис. 6.2) [53].

Микробные биоплёнки широко распространены в природе, особенно при наличии контакта физиоло­

Рис. 6.2. Микробные биоплёнки в дентинных канальцах и на стенках корневого канала.(Гистологический образец предостав­ лен доктором D. Ricucci.)

видов биоплёнок - зубной налёт. Фактически боль­ шинство представителей микрофлоры полости рта спо­ собно к образованию биоплёнки на поверхности зуба. Все полученные данные об этих специфичных структу­ рах также применимы для биоплёнки, расположенной на стенках корневого канала, (рис. 6.6).

Независимо от среды, рост биоплёнок, видимо, раз­ вивается, начинаясь с адсорбции макромолекул, к кото­ рым присоединяются микроорганизмы. Впоследствии происходит сцепление других микроорганизмов, их присоединение может быть усилено синтезом полиме­ ров и развёртыванием структур на поверхности клеток. Размножение и метаболизм прилегающих к поверхно­ сти микроорганизмов в конечном итоге заканчиваются развитием структурно организованного микробного сообщества, которое находится в состоянии баланса с окружающей средой [7, 37]. у многих естественных биоплёнок очень разнообразная микрофлора с инди­ видуальными разновидностями, также функционально организованными. Когда рассматривают зрелые био­ плёнки, используя бесконтактные неразрушительные методы [например, конфокальную лазерную скани­ рующую микроскопию (КЛСМ)], регистрируют зна­ чительные структурные особенности, включающие микроколонии бактерий, встроенные во внеклеточ­ ную матрицу с каналами или порами, проникающими на всю толщину биоплёнки [4,15].

Дентинные

Стенки

канала

область

Биоплёнки в корневых каналах

Доказательством наличия биоплёнок в корневых каналах служат результаты оптической, трансмис­

[33, 47]. Состоящие из нескольких морфотипов био­ плёнки растут в мультислоях или в виде скоплений на стенках дентина корневого канала (рис. 6.3 и 6.4), или в виде плотных скоплений в некротической ткани (рис. 6.5). Аморфный материал, заполняющий межбактериальные пространства в биоплёнках, интерпретировали как являющийся внеклеточной матрицей бактериального происхождения. Во многих случаях пространственная организация биоплёнок корневого канала напоминает зубные биоплёнки [32]. Следовательно, были описаны палисадные

структуры нитей и цепи кокков, расположенные пер­ пендикулярно к стенкам канала [46], или подобные кукурузному початку структуры кокков, присоеди­ нённых к нитям [44].

Из-за трудностей доступа КЛСМ к биоплёнке в есте­ ственных условиях информация о детальной архи­ тектуре довольно ограничена. Однако двусторонняя возможность быстрого движения молекул, таких как питательные вещества и продукты метаболизма микро­ бов, существует.

микробные агрегаты. Они были замечены главным обра­ зом в клинических случаях с острыми симптомами, как с наличием свищевого хода, так и без него. Также суще­ ствуют данные о наличии таких колоний в случаях без­ результатного эндодонтического лечения.

Микроорганизмы непрерывно отделяются от поверхности биоплёнок и обсеменяют другие участки. При эндодонтических инфекциях свободные микро­ организмы: могут выйти из апикального отверстия и, по крайней мере временно, участвовать в периапикальном поражении ткани per se, присутствовать в сво­ бодно взвешенном состоянии или внутри фагоцитов.

Такая ситуация обычна для апикальных абсцессов,

поражениях обтурированных корней зубов [59]. Высокоорганизованные поражения тканей, так назы­ ваемые апикальные гранулёмы (см. главу 7), обычно не инфицированы. Исключение из этого правила - случайное обнаружение колоний, содержащих актиномицеты [48]. Корневые кисты могут также содер­ жать скопления микроорганизмов [49].

116 Некротизированная пульпа

ПЕРЕДОВЫЕ АСПЕКТЫ 6.1

Микробные биоплёнки имеют признаки гетерогенности

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ 6.2

Микробные взаимодействия в полимикробном сообществе

Синергия

Образование конгломератов.

Поддержание анаэробной среды.

Комплементация ферментов для согласованного расщепления макромолекул.

Пищевые цепочки.

Защита соединений.

Антагонизм

Борьба за место и питательные вещества.

Ингибирование продуктов метаболизма.

Бактериоцины.

Экологические детерминанты микробного роста в корневых каналах

Как и в случае с зубной бляшкой [38], адгезия и сцепле­ ние - ключевые экологические детерминанты для выжи­ вания и персистенции бактерий полости рта в просвете корневого канала. Низкое содержание кислорода

ипитательных веществ - другие важные экологические факторы, определяющие успех или неудачу выживания

ироста микроорганизмов, поступающих в корневой канал (см. «Фундаментальные аспекты 6.1»). Биоплёнки корневого канала содержат множество разновидностей

микроорганизмов в близком физическом контакте, и это увеличивает вероятность и синергичных, и анта­

из множества разновидностей, и микробные взаимо­ действия в конечном итоге обеспечивают стабильность сообщества. Этот способ колонизации даёт начало химической гетерогенности в среде биоплёнки, которая стимулирует фенотипическое разнообразие, что увели­ чивает способность микроорганизмов противостоять местным экологическим изменениям (см. «Передовые аспекты 6.1»), После формирования стабильной био­ плёнки только механическое воздействие и антисепти­ ческая обработка смогут предотвратить разрушитель­ ное воздействие микробного сообщества.

Питание

Проникающие в некротизированную ткань корневых каналов микроорганизмы попадают в среду, благопри­ ятную для роста. Некротизированная ткань, тканевая жидкость и воспалительные экссудаты из апикальных

тканей удовлетворяют основные потребности в угле­ роде, азоте, минеральных солях и энергии, а также особые потребности в аминокислотах, нуклеотидах, витаминах и гемине [62]. Питательные вещества могут быть получены как непосредственно из этих источни­ ков, так и путём расщепления макромолекул, таких как белки и гликопротеины. Этот процесс требует согласованного действия ферментов, синтезируемых различными видами микроорганизмов в микробном сообществе. Полученные углеводы, фрагменты пепти­ дов и аминокислот служат питательными веществами и источником энергии для многих представителей биоплёнки. Микроорганизмы биоплёнки могут также извлечь пользу из межмикробных пищевых цепочек, где конечные продукты метаболизма (например, NH3, С02 и органические кислоты) одной разновид­ ности служат питательными веществами для других. Вследствие небольшого количества углеводов, доступ­ ных напрямую или полученных при расщеплении гли­ копротеинов, ограничивается рост микроорганизмов, требующих углеводы для энергии, тогда как микро­ организмы, расщепляющие белки и аминокислоты, имеют в данном случае преимущество. Это приводит к высокому содержанию протеолитических бактерий

вэндодонтической микробиоте. Питательные усло­ вия в корневом канале во многом похожи на условия

вподдесневых зубных биоплёнках [58].

После удаления некротизированных тканей кор­ невых каналов и обеспечения контроля над апи­ кальным воспалительным процессом питательных веществ для патогенных микроорганизмов будет недостаточно. В природе микроорганизмы могут выжить в таких условиях только с помощью пере­ стройки метаболизма. На сегодняшний момент данные об этом довольно ограничены, но микроор­ ганизмы, вероятно, регулируют свой метаболический

баланс, избегая размножения с целью сохранения энергии для выживания [21]. Вполне возможно, что принятие статичного состояния может быть важным механизмом выживания в среде корневого канала, лишённой питательных веществ [12].

Окислительно-восстановительный потенциал

В целом количество кислорода и окислительно-вос­ становительный потенциал в корневых каналах довольно низки, что привычно для анаэробных микроорганизмов и нескольких видов факультатив­ ных анаэробов, а также редких облигатных аэробов. Что касается зубных биоплёнок, любое поступление кислорода в корневой канал, например со слюной, будет использоваться факультативными анаэробами, ферменты которых осуществляют перенос кислорода для удаления токсичных продуктов. Следует подчер­ кнуть, что невозможность проникновения кислорода сквозь биоплёнку не является результатом физиче­ ского процесса, так как внеклеточный матрикс био­ плёнок пропускает кислород [19]. Однако кислород не будет достигать внутренних слоёв, потому что он активно потребляется факультативными анаэробами в биоплёнке. Таким образом, в плотных микробных биоплёнках преобладают низкое содержание кис­ лорода и низкий окислительно-восстановительный потенциал, пригодные для облигатных анаэробов.

Микробные взаимодействия в биоплёнках

Биоплёнки корневого канала содержат разные микро­ организмы полости рта, способньге к взаимодействию. Доказательством вышеописанного служит аккумуляция в биоплёнках тех членов микробного сообщества, кото­ рые активно вовлечены в широкий диапазон метаболи­ ческих, молекулярных и физических взаимодействий, важных для прикрепления, роста и выживания разно­ видностей микроорганизмов. Таким способом микро­ организмы адаптируются к неблагоприятным усло­ виям (см. «Фундаментальные аспекты 6.2»), Хорошим примером образования микроорганизмами сообществ служит потребление кислорода факультативными анаэробами. Накопление продуктов их метаболизма создаёт среду, подходящую для облигатных анаэробов [8]. Другой пример взаимодействий, которые приносят пользу патогенным микроорганизмам, - использование необходимых для метаболизма сложных гликопротеи­ нов и белков организма-хозяина. Эти молекулы обыч­ но не поддаются диссимиляции индивидуальными микроорганизмами, но могут быть легко расщеплены совместным действием микроорганизмов в микробных сообществах.

Микробиология некротизированной пульпы 117

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ 6.3

Проблемы культивирования бактерий корневого канала

Взятие образцов

Недоступность местоположения.

Контаминация.

Транспортировка

Гибель микроорганизмов.

Чрезмерный рост микроорганизмов.

Культивирование

Неподходящий субстрат.

Неподходящий анаэробиоз.

Некультивируемые микроорганизмы.

Идентификация

Трудоёмкие лабораторные процедуры.

Дороговизна.

Неопредёленность систематики.

методики способны решить некоторые из этих проблем.

В дополнение к обычным метаболическим взаи­ модействиям, в биоплёнках корневого канала среди микроорганизмов могут встречаться более тонкие взаимодействия, такие как межклеточная переда­ ча сигналов. Множество разновидностей бактерий полости рта развили сигнальные системы, которые, вероятно, помогают им приспособиться и пережить создаваемые организмом изменения в окружающей

и могут привести к координации гена и белковой экспрессии в рамках микробного сообщества. Такие

ства в инфицированном корневом канале. В насто­ ящее время их рассматривают как потенциальные мишени для новых методов лечения [52].

Выше приведены примеры того, как бактериальные микроорганизмы на поверхности биоплёнки предостав­ ляют защиту микроорганизмам подлежащей или более глубокой её части. Все члены сообщества могут также извлечь пользу из способности некоторых разновидностей инактивировать защиту организма-хозяина, расщепляя антитела и ингибируя фагоцитоз. Однако встречаются

иантагонистические отношения. К примеру, некоторые конечные продукты метаболизма (НчОч, жирные кислоты

исернистые соединения) могут накапливаться в концен­ трациях, ингибирующих или токсичных для других раз­ новидностей. Кроме того, антимикробные пептиды, так называемые бактериоцины, синтезируемые некоторыми

118 Некротизированная пульпа

видами, влияют на другие чувствительные разновидно­ сти, приостанавливая их рост.

Антимикробная резистентность

Важный аспект контроля над биоплёнкой - использова­ ние поверхностно-активных веществ, антимикробных средств и антикоагулянтов. Антимикробные средства часто разрабатывали и оптимизировали против быстро­ растущих конкретных разновидностей. Важная особен­ ность инфицирования корневого канала, подтверж­ дённая многочисленными исследованиями, - защита бактерий от действия биоцидов, дезинфицирующих средств и антибиотиков. Существуют данные о том, что микроорганизмы, выращенные в биоплёнках, устойчивее соответствующих планктонных форм от 2 до 1000 раз [22]. Относительно бактерий полости рта ингибирующие кон­ центрации хлоргексщ;ина и фторидов в 300 и 75 раз выше соответственно, когда Streptococcus sobrinus выращен в виде биоплёнки по сравнению со свободно взвешенными бак­ териями [54]. Было также обнаружено, что биоплёнки бактерий полости рта более устойчивы к амоксициллину, доксициклину и метронидазолу [29].

Защитные механизмы, лежащие в основе антими­ кробной устойчивости биоплёнки, до конца не изуче­ ны, но в литературе встречается описание нескольких возможных механизмов [22]. Структура и массивная организация сообществ биоплёнки в пределах поли­ мерной матрицы могут ограничить проникновение веществ в биоплёнку, оставляя микроорганизмы в её глубинах неповреждёнными. В процессе проник­ новения возможна даже инактивация вещества-агента. Кроме того, в закончившей начальный рост биоплёнке бактерии, лишённые питательных веществ, растут мед­ ленно. Как следствие, они намного менее восприимчи­ вы, чем быстро размножающиеся бактерии. Бактерии биоплёнки могут также представлять различный фено­ тип, который обеспечивает увеличенную устойчивость.

ные исследования. Так, культуры Enterococcus faecalis, помещённые в корневые каналы, как обработанные гидроксидом кальция, так и необработанные, в состо­ янии сформировать структуры биоплёнки на стенках канала [20]. Похоже, формирование биоплёнки позво­ ляет микроорганизму противостоять лечению. Так же как возможные изменения в концентрации ионов гидроксила, воздействию которых подвергаются бак­ терии корневого канала, они, как известно, варьируют в их свойственной способности не поддаваться щелоч­ ным изменениям pH [10,11].

Методы изучения микрофлоры корневого канала

Микрофлору некротизированной пульпы изучают более 100 лет, главным образом с помощью прямой микроскопии и культивирования. Большинство инфор­ мации получено при исследовании состава, экологии и патогенного потенциала микрофлоры. В клинической практике культуры корневого канала используют для определения микробиологического статуса и оценки эффективности лечебных мероприятий до завершения лечения обтурацией канала. Однако вследствие различ­ ной локализации микроорганизмов и избыточного раз­ нообразия видов микрофлоры существуют некоторые методологические проблемы при использовании опи­ санного подхода (см. «Фундаментальные аспекты 6.3»),

Много лет методы взятия проб, транспортировки, культивирования и идентификации были в значи­ тельной степени неподходящими для многих при­

культуры (отсутствие роста, несмотря на наличие микроорганизмов, обитающих в корневом канале). Ложноположительные культуры (рост контаминирующих микроорганизмов, не представленных в корневом канале) были также типичным случаем. Конечно, важ­ нейшими являются оптимальные методы для миними­

[43]. Методы микробной идентификации, как с куль­ тивированием, так и без него, развиваются очень быстро, поэтому названия и таксономическое местопо­ ложение многих бактерий изменяются с появлением новой информации. Общая последовательность обна­ ружения и идентификации микроорганизмов корне­ вого канала представлена на рис. 6.8.

Взятие проб

с пальцев и инструментов следует обеспечить асептичные условия. Необходимо иссечь кариес, удалить старые реставрации, искусственные коронки, бляшку и зубной камень, обязательно наложить раббердам. Абсолютно необходима дезинфекция тканей зуба и компонентов раббердама. Используют стерильные боры и инстру­ менты для получения доступа к корневым каналам, а образцы берут стерильными бумажными штифтами. Канал может содержать воспалительный экссудат, который можно использовать в процессе взятия проб. Если он отсутствует, необходимо ввести небольшое количество стерильной жидкости. Лёгкими движени­

ями инструмента, соответствующего диаметру канала, со стенок канала соскабливают некротическую ткань и фрагменты твёрдой ткани. Полученную взвесь адсор­ бируют достаточным количеством бумажных штифтов. Штифты следует немедленно поместить в контейнер с транспортной средой, специально разработанной для поддержания жизнедеятельности (но не роста) организ­ мов во время транспортировки в лабораторию.

Культивирование

Перед культивированием в лаборатории микроорга­ низмы должны быть сначала равномерно размешаны в растворе, например энергичными движениями стеклянной палочки. Образцы высеивают на агарные

Neisseria sp.

Actinomyces sp.

среды и инкубируют достаточно длительное время (10-14 дней), чтобы позволить даже медленно растущим микроорганизмам сформировать колонии. В бульонной среде наиболее быстро растущие бактерии помешают росту остальных, поэтому представители смешанной микрофлоры будут отсутствовать [62]. Неселективные агаровые среды, содержащие гемолизированную кровь (рис. 6.9), отвечают многим особым питательным требо­ ваниям и лучше всего подходят для культивирования разных бактериальных типов, например, дрожжей [43]. Можно использовать селективные среды, например агар Sabouraud для дрожжей, стрептококковый (mitis salivarius) агар для стрептококков или агар Rogosa SL для лактобацилл. Нужны специальные среды для роста микоплазм и спирохет, но их тяжело культивировать даже на специальных средах [43].

Факультативные анаэробные грамположительные кокки

Анаэробные стрептококки

Veillonella sp.

1 2 0 Некротизированная пульпа

Рис. 6.10. Визуализация бактерий в корневых каналах,

(а) Витальная окраска (подсветка живой/мёртвый) микробной

биоплёнки, состоящей из многочисленных волокнистых микро­ организмов коккоподобных форм. Флюоресцентным зелёным

Поскольку микроорганизмы, колонизирующие кор­ невые каналы, - факультативные и облигатные анаэ­ робы, для точных результатов крайне важны анаэроб­ ные методы транспортировки и инкубации культур. Это требование может быть выполнено инкубацией в анаэробных контейнерах или анаэробных ящиках, позволяющих работать и производить инкубацию без доступа кислорода. Чтобы облегчить идентификацию факультативных анаэробных и капнофильных бакте­ рий (буйно разрастающихся в присутствии углекислого газа), ряд чашек с агаром выращен в воздухе с добавле­ нием углекислого газа. Обычно одну-две колонии каж­ дого типа пересевают для идентификации. Поскольку у различных бактерий могут быть схожие по морфо­ логии колонии, в некоторых случаях лучше выделить большое количество колоний.

Прямая микроскопия

Непосредственное наблюдение с помощью фазово-кон- трастной или темнопольной микроскопии, растровой электронной микроскопии или микроскопии мазков, окрашенных по Граму, позволяет проводить наблю­ дение за всеми присутствующими морфологически­ ми типами - даже не выявленными в культурах [18]. Наличие определённых бактерий может быть опреде­ лено в мазках, окрашенных косвенной иммунофлюоресцентной техникой [3]. Флюоресцентную микроско­ пию в сочетании с витальной/девитальной окраской можно использовать для визуализации морфологиче­ ски различных типов (рис. 6.10), хотя надёжность таких окрасок для определения жизнеспособности не совсем оптимальна [31]. Коммерчески доступен широкий диа­ пазон флюоресцентных исследований; при объедине­ нии с флюоресцентной микроскопией они позволяют выяснить физиологическое состояние индивидуальных микроорганизмов в образце. Эти физиологические

пробы разработаны с целью исследования различных клеточных функций, таких как метаболическая актив­ ность, целостность клеточной мембраны, мембранный потенциал, ферментная активности и синтез нуклеино­ вых кислот [27]. Описанные методы важны для оценки антимикробного эффекта бактерицидных препаратов

мов в сложных сообществах, служит использование методики флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Предпочтительный способ наблюдения - КЛСМ с флюоресцентными олигонуклеотидными исследованиями, предназначенными для рибосомальных РНК (рРНК) бактерий [2]. При использова­ нии данной методики микроорганизмы фиксирова­ ны для стабилизации морфологии и проницаемости мембраны клетки, чтобы позволить маркёрам рас­ пространяться на их внутриклеточные рРНК [45]. Неудача в обнаружении целевых клеток с помощью FISH чаще всего вызвана недостаточной проницаемо­ стью клетки, низким содержанием рибосом в клетке или недоступностью участка для исследования [1]. Методы FISH успешно используют для идентифика­ ции некоторых разновидностей бактерий при апи­ кальных поражениях [59].

Методы идентификации

Точная идентификация на уровне разновидностей эндодоптических штаммов бывает трудоёмкой, доро­ гостоящей и не всегда возможна, потому что множество представителей микрофлоры полости рта недостаточно изучено. Некоторые из них даже невозможно культиви­ ровать. Однако детальная идентификация микроорга­ низмов является существенной, например, для установле­