Курс лекций (Доркина) - микробиология

трихофитии, микроспории, парши, эпидермофитии.

Микроскопическое исследование грибов производят в неокрашенных препаратах – в "раздавленной" или "висячей" капле.

Простейшие составляют подцарство Protozoa, принадлежащее к царству Животные (Animalia). Это одноклеточные эукариотические организмы (5-30 мкм). Простейшие включают 7 типов, из которых 3 типа имеют патогенных представителей.

Строение клеток простейших соответствует эукариотам: мембрана (пелликула) – аналог ЦПМ; ядро (одно или несколько) с ядрышком и ядерной оболочкой, эндоплазматическая сеть, митохондрии, лизосомы, многочисленные рибосомы. Некоторые имеют опорные фибриллы. Имеют специальные сократительные и пищеварительные вакуоли. Питаются путем фагоцитоза или образуют специальные структуры. Передвигаются при помощи жгутиков, ресничек, путем образования псевдоподий. Размножение осуществляется простым делением и половым путем.

Царство Animalia



К жгутиконосцам (п/тип Mastigophora) относятся простейшие, имеющие один или несколько жгутиков (органы движения) и ундулирующую мембрану у трипаносом и трихомонад. К ним относятся такие патогенные представители, как:

-трипаносомы – возбудители африканского трипаносомоза (сонной болезни) и американского трипаносомоза (болезни Шигаса);

-лейшмании – возбудители кожного и висцерального лейшманиозов;

-трихомонады – поражают кишечник и мочеполовые пути человека;

-лямблии – возбудители лямблиоза (заболевания тонкой кишки).

Ксаркодовым (п/тип Sarcodina) относится дизентерийная амеба, паразитирующая в толстом кишечнике. Передвигается при помощи псевдоподий. Половой путь размножения отсутствует. В жизненном цикле встречаются следующие формы: цисты (четырехядерные), мелкая вегетативная, крупная вегетативная и тканевая формы. Вегетативные (просветные) формы обитают в просвете кишечника, питаясь его содержимым, и не наносят вреда. При снижении резистентности организма они внедряются в слизистую оболочку кишечника и превращаются в тканевую форму, питающуюся клетками стенки кишечника и эритроцитами. В результате на слизистой оболочке образуются язвы, и развивается амебная дизентерия (кишечный амебиаз). Вегетативные формы во внешней среде погибают. Цисты устойчивы.

Класс Sporozoa (тип Apicomlexa) представлен только паразитическими формами. К нему относятся возбудители малярии, токсоплазмозов, кокцидиозов, саркоцистозов, пневмоцистоза. Возбудитель малярии – малярийный плазмодий – имеет сложный жизненный цикл, характеризующийся чередованием полового размножения (спорогонии в организме самки комаров рода Anopheles) и бесполого (шизогонии в клетках тканей и эритроцитах человека). Возбудитель токсоплазмоза – токсоплазма – имеет форму полулуний. Это заболевание распространено среди всех млекопитающих. Заражение человека происходит от животных. Токсоплазмы могут проникать через плаценту и

поражать нервную систему и глаза плода.

К типу Ciliophora относится возбудитель балантидиаза – равнореснитчатая инфузория Balantidium coli. Тело ее покрыто многочисленными ресничками, при помощи которых инфузория передвигается. В клетке имеется два ядра. Балантидиаз – тяжелая форма колита с поражением толстого кишечника. Источник заражения – свиньи, у которых балантидий паразитирует в кишечнике.

Простейших исследуют в живом виде или применяют сложные методы окраски. По Романовскому-Гимзе цитоплазма окрашивается в синий цвет, а ядро в красный.

ЛЕКЦИЯ № 4

Особенности строения и жизнедеятельности вирусов и бактериофагов. Препараты бактериофагов для лечения и профилактики инфекционных заболеваний.

Вирусы не имеют клеточного строения. Это неклеточные формы жизни. Они относятся к царству Vira. Размеры выражаются в нанометрах (нм); 1 нм = 10-3 мкм. Они не видны в световой микроскоп и проходят через бактериальные фильтры.

Вирусы были открыты в 1892 г. Д.И. Ивановским. В настоящее время известно больше, чем 600 возбудителей вирусных инфекций у человека: оспы, бешенства, гриппа, паротита, кори, полиомиелита, клещевого энцефалита, геморрагической лихорадки, СПИДа и др.

Вирусы – это облигатные внутриклеточные паразиты. Они проникают в живую клетку и размножаются внутри клетки. Поэтому на искусственных питательных средах вирусы расти не могут.

Выделяют две формы вирусов: а) внеклеточная форма – вирион; сформированная вирусная частица; б) внутриклеточная форма или вегетативная форма –

размножающийся вирус.

Строение вириона.

Морфологию и структуру вирионов изучают при помощи электронного микроскопа. Вирионы имеют размеры от 15-18 нм-300-400 нм и различную форму: палочковидная, пулевидная, сферическая и др

Вирионы состоят из ДНК или РНК и белков. Это комплексы нуклеиновых кислот и белков - нуклеопротеиды. ДНК или РНК находятся в центре, а снаружи – одна или две оболочки.

Функции ДНК или РНК - хранение и передача наследственной информации. Функции белков: а) защитная функция (белки капсида);б) стабилизация

структуры нуклеиновой кислоты (внутренние белки);в) ферментативная функция; ферменты вирусной частицы участвуют в проникновении в клетку (лизоцим, АТФаза и т.д.), в репликации и транскрипции (ДНК- и РНК-полимеразы).

Если вирусы имеют одну оболочку, они называются простыми. Эта оболочка состоит из белковых субъединиц – капсомеров и называется капсид. Нуклеиновая кислота и капсид вместе называются нуклеокапсидом.

Если вирусы имеют две оболочки они называются сложными. Вторая оболочка называется суперкапсид. Суперкапсид образуется при выходе вируса из клетки-хозяина, поэтому в его составе имеются углеводы и липиды мембраны этой клетки.

Липиды и углеводы сложных вирусов образуют комплексы с белками – липопротеиды и гликопротеиды. Они защищают вирусы от неблагоприятных условий. Гликопротеиды – вирусные антигены – гемагглютинины, которые вызывают реакцию агглютинации эритроцитов.

В основу классификации вирусов положены следующие принципы: тип нуклеиновой кислоты, ее структура, количество нитей, размер и морфология вирионов, количество капсомеров и тип симметрии, наличие суперкапсида, чувствительность к эфиру и дезоксихолату, место размножения в клетке, антигенные свойства и др.

Вирусы делят на два подцарства: ДНК-вирусы и РНК-вирусы. Название семейства оканчивается на viridae, подсемейства – на virinae, рода - на virus. Вид вируса не получил бинарного названия как у бактерий. Например, вирус бешенства – РНК-вирус, относится к семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavirus.

Взаимодействие вируса с клеткой.

Размножение вирусов протекает внутри живой клетки-хозяина. Нуклеиновые кислоты и белки синтезируются клеткой-хозяином раздельно в разных частях клетки. После этого они объединяются друг с другом. Такой способ называется разобщенная или

дизъюнктивная репродукция.

Репродукция вирусов внутри клетки протекает в несколько стадий.

1.Адсорбция – прикрепление вирусов к поверхности клетки на рецепторах. Для этого у вирусов также имеются специальные поверхностные структуры (шипы). Они специфически прикрепляются к рецепторам клетки.

2.Проникновение в клетку – вирусы проникают в клетку двумя способами: а) пиноцитоз; б) слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной.

3.Дезинтеграция ("раздевание") – удаление оболочек и освобождение ДНК или РНК. Вирусная частица распадается на нуклеиновую кислоту и белки. В результате вирус нельзя обнаружить в клетке никакими чувствительными методами, он как бы исчезает, растворяется. Это явление называется эклипс – "затмение".

4.Синтез ДНК или РНК и вирусных белков. Для репликации, транскрипции и трансляции используются: а) ферменты клетки-хозяина; б) вирионные ферменты; в) вирусиндуцированные ферменты (информация об их структуре содержится в геноме вируса, а синтез протекает внутри клетки).

5.Сборка (морфогенез) вириона – нуклеиновые кислоты и белки соединяются друг

сдругом.

6.Выход из клетки – вирусные частицы выходят из клетки двумя способами: а) одновременно через отверстия в мембране клетки; б) почкование; при этом образуется суперкапсид у сложных вирусов.

Выделяют несколько типов взаимодействия вируса с клеткой:

а) продуктивный тип – активная репродукция с выходом вируса из клетки; б) абортивный тип – образование вирионов внезапно прерывается на какой-то

стадии; в) вирогения – встраивание (интеграция) нуклеиновой кислоты вируса в ДНК

клетки-хозяина. Встроенный вирус называется ДНК-провирус. В результате клетка приобретает ряд новых свойств (могут возникнуть аутоимунные хронические заболевания, опухоли).

Микроскопические методы обнаружения вирусов.

Большинство вирусов обнаруживают при помощи электронной микроскопии. При помощи электронной микроскопии выявлено большое разнообразие морфологии вирусов

иизучена ультраструктура вирусных частиц.

Всветовом микроскопе видны только крупные вирусы (200 нм и больше). Эти вирусы окрашивают по Романовскому-Гимзе и рассматривают при иммерсионной микроскопии.

Вирусы меньше, чем 200 нм окрашивают серебрением по Морозову. Они увеличиваются в размерах и под световым микроскопом вирусы имеют черный цвет и круглую форму. Вирусы оспы, окрашенные по Морозу, - тельца Пашена.

Для диагностики вирусных инфекций в пораженных клетках обнаруживают вирусные тельца или включения. Это скопления вирусных частиц или колонии вирусов в клетке. Они окрашиваются специальными методами и изучаются с помощью светового микроскопа. Образование внутриклеточных включений отмечено при многих вирусных инфекциях. Включения имеют разную величину (от 0,25 до 20-30 нм) и форму (круглая,

овальная, грушевидная, веретенообразная, неправильная).

Например, при бешенстве в цитоплазме нервных клеток обнаруживаются тельца Бабеша-Негри. При натуральной оспе в цитоплазме эпителиальных клеток обнаруживаются тельца Гварниери.

Морфология бактериофагов и особенности их взаимодействия с бактериальной клеткой.

Бактериофаги ("пожиратели бактерий") – это вирусы бактерий. Размеры такие же, как у вирусов, – 20 – 200 нм. Как и вирусы, бактериофаги проходят через бактериальные фильтры и размножаются только в живых клетках. Бактериофаги в природе находятся там, где бактерии: в воде, почве, молоке, в организме людей и животных.

С помощью электронного микроскопа показано, что большинство бактериофагов имеют форму головастика или сперматозоида. Они состоят из головки и хвостового отростка. Отросток – стержень с чехлом. Стержень заканчивается шестиугольной пластинкой с короткими шипами, от которых отходят фибриллы. Чехол может сокращаться. Внутри головки находится ДНК. ДНК окружена капсидом. В отростке находятся ферменты – лизоцим и АТФаза. Они участвуют в проникновении фага в клетку.

Взаимодействие бактериофага с бактериальной клеткой называется бактериофагией. Стадии взаимодействия фага с клеткой такие же, как и у вирусов: адсорбция, проникновение в клетку, синтез нуклеиновых кислот и белков, морфогенез, выход из клетки. Но имеются особенности. Фаги обладают строгой специфичностью взаимодействия. Определенный фаг взаимодействует с определенным видом или даже подвидом бактерий. По этому название бактериофагов такие же, как видовые или родовые названия тех бактерий, с которыми они взаимодействуют. Например, стафилофаги, дизентерийные фаги и т.д.

Интересен процесс проникновения фагов с хвостовыми отростками в клетку. Эти фаги адсорбируются при помощи фибрилл, сокращается чехол (при помощи АТФазы), и стержень внедряется в клетку (при помощи фермента лизоцима). ДНК проходит через стержень в цитоплазму клетки. Капсид и отросток остаются вне клетки. Через 5 минут начинается синтез нуклеиновых кислот и белков, а через 30-40 минут бактериальная клетка разрушается (лизируется). В окружающую среду выходит около 200 новых фаговых частиц.

Явление бактериофагии можно обнаружить при выращивании бактерий на жидких и плотных питательных средах. На жидких средах при действии фагов наблюдается просветление жидкости с бактериальной культурой. . На твердых средах на фоне сплошного роста бактерий образуются стерильные пятна круглой или неправильной формы. Они образуются на месте разрушения (лизиса) бактерий. Это "негативные колонии" бактериофага.

Различают: а) поливалентные фаги – взаимодействуют с родственными видами бактерий; б) моновалентные – взаимодействуют с одним определенным видом; в) типовые фаги – взаимодействуют с отдельными вариантами (типами) данного вида бактерий.

Фаги делятся на вирулентные и умеренные. Вирулентные фаги проникают в клетку, размножаются в ней и вызывают ее лизис. Умеренные фаги проникают в клетку и встраиваются в хромосому бактерии. Лизис при этом не происходит. Встроенный в хромосому бактерии фаг называется профагом. Бактериальные клетки, содержащие профаг, называются лизогенными, а само явление – лизогения. Лизогенные бактерии имеют дополнительные свойства (образование токсинов и др). Изменение свойств называется фаговой конверсией. Под влиянием УФ лучей и химических веществ профаг может превращаться в вирулентный фаг. Это явление называется индукцией фага.

Умеренные фаги – мощный фактор изменчивости микроорганизмов и могут нанести вред микробиологическому производству

Получение и применение бактериофагов. Для получения препаратов бактериофагов используют проверенные производственные штаммы фагов и соответствующие им типичные культуры бактерий. В бактериальную культуру в жидкой питательной среде вносят маточную взвесь фага. После просветления (лизиса) культуру фильтруют через бактериальные фильтры, и фильтрат вносят в свежую культуру соответствующих бактерий и т.д. После накопления достаточного количества фага лизированную им культуру бактерий вновь фильтруют, и получают препарат фага.

Таким образом, препараты фагов получают путем многократного пассирования через чувствительную бактериальную культуру, а сами препараты фагов – фильтраты бульонных культур лизированных ими бактерий. Это прозрачные жидкости светложелтого цвета, а также на их основе готовят другие лекарственные формы - таблетки с кислотоустойчивым покрытием, мази, аэрозоли, свечи.

Применение фагов основано на их строгой специфичности. Они используются для: а) диагностики инфекционных заболеваний (диагностические препараты): с

помощью известного фага можно определить вид или подвид бактериальной культуры;

б) лечения и профилактики заболеваний (лечебно-профилактические препараты).

Лечебно-профилактические препараты бактериофагов.

В настоящее время в Российской Федерации выпускают бактериофаги для лечения и профилактики кишечных инфекций: дизентерийный поливалентный,

сальмонеллезный поливалентный групп АВСДЕ, брюшнотифозный и бактериофаги против основных возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний: стафилококковый,

стрептококковый, синегнойный, протейный, клебсиеллезный, коли-фаг. Разработаны комбинированные препараты: коли-протейный, пиобактериофаг (против стафилококков, стрептококков, клебсиелл, протея, синегнойной и кишечной палочек), интести–бактериофаг (против шигелл, сальмонелл, стафилококков, энтерококков, кишечной и синегнойной палочек, протея).

Поливалентные препараты – смеси из нескольких фагов против различных типов одного вида бактерий. Комбинированные препараты – смеси из фагов против бактерий

разных видов.

Механизм действия: 1) лизис (гибель) бактерий в очаге воспаления; 2) стимуляция иммунитета.

Преимущества: 1) специфичность действия (вызывают гибель определенного вида бактерий); 2) не подавляют нормальную микрофлору организма человека, как антибиотики; 3) нет противопоказаний и осложнений; 4) можно использовать в сочетании с другими лекарственными средствами; 5) активны против бактерий, устойчивых к антибиотикам; 6) можно использовать для профилактики заболеваний.

Недостатки: 1) быстро выводятся из организма; 2) срок годности 12 – 24 мес; 3) хранятся при температуре +2 - 10 С.

Важное условие успешного применения бактериофагов: чувствительность возбудителя к данному бактериофагу. Лечение фагами нужно начинать в первые дни заболевания. Вводить препараты нужно в места локализации возбудителя.

Препараты назначают внутрь (через рот и в виде клизм), местно для орошения ран и слизистых оболочек, вводят в полости матки, мочевого пузыря, уха, придаточных пазух, в брюшную и плевральную полости, а также в полости абсцессов после удаления гноя и экссудата. Так как бактериофаги разрушаются кислотами, поэтому препараты, которые назначают для приема через рот, имеют кислотоустойчивое покрытие.

Отсутствие противопоказаний и осложнений, возможность использования в сочетании с другими средствами, в том числе антибиотиками, активность в отношении антибиотикорезистентных штаммов и адаптация бактериофагов к современным возбудителям – все это позволяет оценить препараты бактериофагов как высокоэффективное и перспективное средство экстренной терапии гнойно-септических и кишечных инфекций.

ЛЕКЦИЯ № 5

Физиология бактерий. Типы питания, дыхания. Рост и размножение бактерий. Ферменты бактерий. Методы изучения ферментативной активности бактерий.

Физиология бактерий изучает жизнедеятельность бактерий, их питание, дыхание, метаболизм, рост и размножение.

Типы и механизмы питания бактерий.

Для питания бактерии используют самые разнообразные неорганические и органические соединения, что определяет широту их распространения в природе и огромное разнообразие типов питания. Разнообразие типов питания у бактерий определяет их огромное значение в осуществлении круговорота различных элементов в природе

Бактерии нуждаются в таких элементах, как кислород, водород, углерод, азот, сера, фосфор, калий и др. Источниками водорода и кислорода являются вода и кислород воздуха у аэробных микробов.

По источнику углерода бактерии делят на:

-автотрофы – источником является СО2;

-гетеротрофы – источниками являются различные органические соединения (глюкоза, спирты, аминокислоты, органические кислоты);

По источнику энергии:

-фототрофы – используют энергию солнечного света;

-хемотрофы – используют энергию химических реакций окисления неорганических

иорганических соединений.

По донору Н2 (е):

-литотрофы – донором являются неорганические соединения (Н2О, H2S);

-органотрофы – донором являются органические соединения (карбоновые кислоты, аминокислоты, глюкоза и т.д.).

По источнику азота:

-аминоавтотрофы – источником является атмосферный азот, аммонийные соли, нитраты, нитриты;

-аминогетеротрофы – источником являются белки (органические вещества).

Фотоавтотрофы – это фотосинтезирующие бактерии, использующие энергию солнечного света для синтеза органических соединений из неорганических соединений.

Хемоавтоторофы синтезируют органические вещества из СО2 за счет энергии реакций окисления неорганических соединений. К ним относятся нитрифицирующие бактерии (NH3 HNO3), серобактерии (H2S S; H2SO4), железобактерии (Fe2+ Fe3+).

Хемо(органо)гетеротрофы для синтеза собственных органических соединений используют энергию окисления других органических веществ, которые являются одновременно и источниками углерода. К ним относится большинство бактерий:

а) сапрофиты, использующие органические вещества отмерших организмов (бактерии брожения и бактерии гниения);

б) симбионты, использующие органические вещества других живых организмов, не нанося им вреда (образуют симбиоз);

в) паразиты, использующие органические вещества живых организмов, нанося им вред. Паразиты бывают облигатные (способны жить и расти только внутри живой клетки) и факультативные (после гибели хозяина питаются сапрофитно).

Микроорганизмы, способные синтезировать все соединения из глюкозы и солей аммония называются прототрофами.

Микроорганизмы, которые не способны синтезировать все соединения, называются ауксотрофами (многие патогенные бактерии).

Вещества, которые микроорганизмы не способны синтезировать, называются

факторами роста. Они должны поступать в клетку в готовом виде. Это аминокислоты, витамины В5, В2, В1, В3, В6, фолиевая кислота, парааминобензойная кислота (ПАБК).

Особенность питания бактерий - поглощение веществ из среды всей поверхностью

тела.

Клеточная стенка пропускает небольшие молекулы (до 600), Н2О, ионы. Цитоплазматическая мембрана обладает избирательной проницаемостью. Мембрана является основным регулятором поступления веществ в клетку.

Механизмы транспорта через мембрану:

а) простая диффузия – вещества транспортируются без затраты энергии по направлению меньшей концентрации;

б) облегченная диффузия – происходит при большей концентрации веществ вне клетки при участии транспортных белков - пермеаз;

в) активный транспорт – осуществляется против разницы концентрации с затратой энергии при помощи транспортных белков;

г) транслокация химических групп – в процессе переноса через мембрану молекула вещества химически изменяется.

Дыхание бактерий.

Дыхание (биологическое окисление) – окислительно-восстановительные реакции, идущие с выделением энергии и образованием АТФ. Субстраты дыхания: глюкоза, аминокислоты, спирты и др.

Аэробное дыхание – участвует кислород. Анаэробное дыхание – без участия кислорода.

При аэробном расщеплении выделяется значительно больше энергии, т.е. оно энергетически более выгодно, чем анаэробное расщепление.

Брожение – неполное окисление в анаэробных условиях.

Продуктами брожения могут быть этиловый спирт, молочная, масляная, уксусная, пропионовая кислоты. Различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое, маслянокислое, пропионовокислое и другие виды брожения.

По типу дыхания бактерии делят на 3 группы:

1.Облигатные аэробы - бактерии, которые могут расти только при наличии кислорода. К ним относятся бруцеллы, микрококки, микобактерии туберкулеза (для роста необходимо около 20% кислорода).

2.Облигатные анаэробы - бактерии, которые растут только при отсутствии кислорода (в анаэробных условиях). Для облигатных анаэробов кислород токсичен, т.к. у них отсутствуют ферменты (каталаза, супероксиддисмутаза), нейтрализующие перекисные радикалы кислорода. К облигатным анаэробам относятся возбудители ботулизма, газовой гангрены, столбняка. Для них характерно сульфатное дыхание, при котором акцептором водорода являются сульфаты, восстанавливающиеся до H2S. При выращивании таких бактерий необходимо создавать анаэробные условия.

3.Факультативные анаэробы - бактерии, которые могут расти как при наличии, так и отсутствии кислорода, т.к. они способны переключаться с анаэробного дыхания на аэробное дыхание. К ним относится большинство патогенных и сапрофитных бактерий (E. coli и др.). Для них характерно нитратное дыхание, при котором акцептором водорода являются нитраты, восстанавливающиеся до N2 и NH3.

Размножение и рост бактерий.

Размножение – увеличение числа особей. Способы размножения бактерий: а)

деление клетки на 2 части (бинарное деление); б) почкование; в) распад нитевидных клеток; г) при помощи спор (актиномицеты).

Рост – увеличение массы в результате синтеза клеточного материала. Во время роста бактерии потребляют питательные вещества, и если объем питательной среды не изменяется, то наблюдается ее истощение и прекращение роста. Культивирование

(выращивание) бактерий в такой среде называют периодическим, а культуру – периодической. Если при культивировании непрерывно подается свежая питательная среда, то такое культивирование называется непрерывным, а культура – непрерывной.

Рост периодической культуры на жидкой питательной среде разделяют на несколько

фаз:.

I фаза – лаг-фаза – период между посевом и началом размножения;

II фаза – фаза логарифмического роста – период интенсивного деления бактерий и рост количества клеток;

III фаза – фаза стационарного роста – количество клеток не меняется и равно максимальной концентрации (М-концентрация);

IV фаза – фаза гибели - снижение количества живых клеток;

V фаза – фаза уменьшения скорости отмирания клеток – клетки переходят в состояние покоя.

На жидких питательных средах рост бактерий может быть: а) поверхностным – образование пленки; б) диффузным – равномерное помутнение среды; в) придонным – образование осадка.

На плотной питательной среде бактерии образуют колонии. Колониия– это макроскопическое скопление микробов одного вида, образовавшееся из одной клетки.

Колонии бывают разными по размеру, форме, цвету, поверхности, форме края, консистенции, структуре.

По размеру колонии бывают крупные (более 5 мм), средние (2 -4 мм), мелкие (1-2 мм) и карликовые (менее 1 мм). Форма бывает круглая, неправильная, ризоидная, звездчатая и др. Поверхность – гладкая, шероховатая, морщинистая, матовая, блестящая, сухая, влажная, выпуклая, плоская и др. Края – ровные, волнистые, зазубренные, бахромчатые и др. Цвет – безцветные, белые, желтые, оранжевые, красные, розовые и др. Консистенция – слизистая, волокнистая, мягкая, плотная, хрупкая и др. Структура – прозрачная, непрозрачная, однородная (гомогенная), неоднородная (гетерогенная) и др.

Колонии, имеющие округлую форму, ровные края и гладкую поверхность – колонии S-формы. Колонии с неровными краями и шероховатой поверхностью –

колонии R-формы. S-форма характерна для вирулентных бактерий. R-форма – для авирулентных (исключение: возбудители сибирской язвы, чумы, туберкулеза и дифтерии).

Характер роста бактерий на жидких и плотных питательных средах называется

культуральными свойствами бактерий.

Ферменты бактерий.

Ферменты – это биологические катализаторы (повышают скорость химических реакций). По химической природе они являются белками.

Как и ферменты других организмов, бактериальные ферменты делят на 6 классов в соответствии с типом катализируемых реакций:

-1 класс – оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции;

-2 класс – трансферазы – катализируют реакции переноса различных групп от одних соединений к другим;

-3 класс – гидролазы – катализируют реакции расщепления веществ на более простые соединения с участием воды;

-4 класс – лиазы – катализируют реакции отщепления (или присоединения) от субстратов различных химических групп негидролитическим путем;

-5 класс – изомеразы – катализируют реакции изомеризации, т.е. превращения органических веществ в их изомеры;

-6 класс – лигазы – катализируют реакции синтеза сложных соединений из более простых соединений.

Ферменты бактерий делят на экзо- и эндоферменты.

Эндоферменты катализируют процессы внутри клетки. Экзоферменты

выделяются бактериями в окружающую среду. Это ферменты: а) пищеварительные ферменты, которые расщепляют сложные питательные вещества до простых веществ; б) защитные ферменты, например, пенициллиназа защищает клеточную стенку от действия антибиотика пенициллина; в) ферменты агрессии – факторы вирулентности патогенных бактерий;

-гиалуронидаза – расщепляет гиалуроновую кислоту;

-дезоксирибонуклеаза – расщепляет ДНК клеток;

-фибринолизин – расщепляет коллаген;

-плазмокоагулаза – свертывает плазму крови;

-нейраминидаза – расщепляет нейраминовую кислоту;

-лецитовителлаза – расщепляет лецитин.

Методы изучения ферментативной активности бактерий.

Состав ферментов бактерий определяется геномом и поэтому характерен для тех или иных видов, т.е. является видовым признаком. Поэтому изучение ферментативных или биохимических свойств очень важно для дифференциации (отличия) и идентификации (определения вида) бактерий. Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз.

Среди ферментов оксидоредуктаз для идентификации микроорганизмов используют такие ферменты, как каталаза и цитохромоксидаза (ЦО).

Каталаза – фермент, расщепляющий Н2О2 с образованием водорода и кислорода. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться после смешивания микробных клеток с 1 % р-ром Н2О2.

Цитохромоксидазу обнаруживают так: смачивают реактивом бумажку и наносят суточную культуру микроорганизмов. Получается синее окрашивание.

Среди ферментов гидролаз изучаются ферменты, расщепляющие углеводы (или сахара) и ферменты, расщепляющие белки (или протеины). Способность бактерий расщеплять углеводы называется сахаролитическими свойствами, а способность расщеплять белки - протеолитическими свойствами.

Эти свойства выявляются по конечным продуктам расщепления после посева на определенные среды.. При распаде сахаров определяют образование кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газов (СО2 или Н2 ), а при распаде белков - образование щелочей, H2S, NH3.

Совокупность сахаролитических, протеолитических и других ферментативных свойств бактерий называется биохимическими свойствами бактерий.

Изучение сахаролитических свойств.

Для определения сахаролитических свойств используются среды: плотные среды Эндо, Левина и Плоскирева, а также жидкие и полужидкие среды Гисса.

Среды Эндо, Левина, Плоскирева содержат лактозу и определенный индикатор. Эти среды позволяют отличить патогенные бактерии от кишечной палочки - E. coli.

E. coli способна расщеплять лактозу, т.к. имеет фермент галактозидазу. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора. Поэтому E. coli образует на средах окрашенные колонии: на среде Эндо - красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы не имеют фермента галактозидазу, они не расщепляют лактозу, и цвет среды не изменяется. Поэтому сальмонеллы и шигеллы образуют на средах Эндо, Левина и Плоскирева бесцветные колонии.

Таким образом, на одной и той же среде наблюдается различный характер роста разных видов бактерий, т.к. они имеют различные ферменты. Это позволяет отличить

один вид от другого.

Среды Гисса содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бактерии расщепляют углевод до образования кислых продуктов,

наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – наблюдают появление газообразных продуктов.

Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенножелтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется.

Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды - розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде.

Определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, поэтому в одних пробирках цвет изменяется, а в других – не изменяется, и получается

"пестрый ряд". Каждый вид бактерий характеризуется своим "пестрым рядом".

Изучение протеолитических свойств.

Протеолитические свойства бактерий изучают:

а) по способности разжижать желатин: разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина; S. aureus – в виде воронки; Bac. antracis – в виде опрокинутой елки;

Vibrio cholerae – в виде гвоздя и т.д. Разжижают желатин бактерии, имеющие фермент -

коллагеназа;

б) по конечным продуктам распада белков после посева на мясо-пептонный бульон (МПБ). Могут быть следующие конечные продукты: индол, Н2S, NH3.

Для обнаружения этих продуктов используют бумажки с индикаторами. Индикатор для индола - щавелевая кислота (бумажка окрашивается в розовый цвет). Для Н2S – ацетат свинца (черный цвет). Для NH3 – лакмусовая бумажка (синий цвет).

Дополнительно изучаются такие свойства, как восстановление нитратов в нитриты, бутандиоловое брожения на среде Кларка, расщепление крахмала и др.

ЛЕКЦИЯ № 6

Культивирование бактерий и вирусов.

Культивирование – искусственное выращивание микроорганизмов. Используется для изучения свойств микроорганизмов и для диагностики инфекционных заболеваний.

Культивирование бактерий.

Для культивирования необходимо: 1) соответствующая среда; 2) правильно произведенный посев; 3) оптимальные условия: температура, влажность, аэрация (снабжение О2) или создание бескислородных условий для анаэробов; 4) определенной время для выращивания (чаще – 24 час).

Требования к питательным средам.

а) среды должны быть питательными - содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества;

б) иметь определенное значение рН; для большинства патогенных микробов оптимальным является рН 7,2-7,4;

в) обладать буферностью – содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена микроорганизмов, для того чтобы не изменялось значение рН среды;

г) быть изотоничными - осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки;