Определение концентрации неорганического фосфора по образованию молибденовой сини Принцип

После осаждения белков с помощью ТХУ неорганический фосфор образует с молибденовой кислотой фосфорномолибденовую кислоту. Последняя восстанавливается эйконогеном до ярко окрашенной молибденовой сини.

Влияющие факторы

Наличие гемолиза, билирубинемия, загрязнение посуды детергентами завышает результаты, применение цитратов, маннитола, оксалатов, тартратов ухудшает окраску и занижает результаты. Ложная гиперфосфатемия может наблюдаться при загрязнении посуды детергентами, повышенном содержании билирубина, гемоглобина. Влияют также суточные ритмы: наивысшие значения поздно утром, самые низкие — вечером. При стоянии сыворотки над кровяным сгустком количество фосфора в ней повышается вследствие выхода из эритроцитов.

Клинико‑диагностическое значение

Уровень фосфора прежде всего зависит от функции паращитовидных и щитовидных желез, регулирующего влияния витамина D, функции почек.

Сыворотка

Гиперфосфатемия наблюдается при почечной недостаточности, токсикозе беременности, заживлении костных переломов, гипопаратиреоидизме, акромегалии, гипертиреозе, метастазах в кости, диабетическом кетоацидозе, передозировке витамина D, остром дыхательном ацидозе, магниевой недостаточности, может быть при миеломной болезни.

Снижение фосфора отмечается при инфузии глюкозы и гиперинсулинизме (инсулин способствует транспорту глюкозы и фосфора в клетки), гиперпаратиреозе, остеомаляции, остром алкоголизме, гипокалиемии, синдроме мальабсорбции, при рахите в детском возрасте, диабетическом кетоацидозе (глюкозурия повышает экскрецию фосфатов с мочой).

Моча

Выделение фосфора возрастает при ускорении катаболических процессов в организме –– гипертиреоз, менингит, диабет, лейкоз, нарушение функции почек. Снижение концентрации в моче отмечается при туберкулезе, гипофункции паращитовидных желез.

Кал

Выведение повышается при недостатке витамина D и стеаторее. Снижается при интоксикации витамином D.

Железо

Железо в организме входит в состав порфириновых соединений, главным образом гемоглобина, миоглобина и порфирина, в небольших количествах оно включается в состав цитохромов и некоторых ферментов. В плазме крови большая часть железа находится в окисленном трехвалентном состоянии и связывается с белком трансферрином (сидерофилином), обнаруживается в составе геминового железа, ферритина и внутрисосудистого гемоглобина. Так называемое геминовое железо является компонентом продуктов неполного синтеза или распада гемоглобина и дыхательных ферментов, которые содержат по одной порфириновой группе и связаны с транспортным сывороточным белком гемопексином.

Трансферрин — гликопротеин β-глобулиновой фракции плазмы крови, имеет два центра связывания железа, присоединяет только трехвалентное железо вместе с анионом гидрокарбоната, синтезируется в печени и РЭС. Функции белка заключаются в связывании железа, превращении его в деионизированную форму и транспорте между тканями, в основном, между печенью и костным мозгом. В отсутствие железа белок может связывать также Cr²⁺, Mn³⁺, Co³⁺, Cu²⁺. Прочность связывания железа с трансферрином снижается при закислении среды, а также при восстановлении железа. В норме насыщено 1/3 общего количества трансферрина, при более чем половинном насыщении железо связывается с другими белками плазмы крови, и поэтому при определении общей железосвязывающей способности сыворотки содержание железа завышается на 15‑20%. При радиальной иммунодиффузии, электрофорезе выявляется полиморфизм трансферрина: у европейцев выявляется тип С, у африканцев и австралийцев — тип D, у канадцев — тип B. 

Ферритин — самый богатый железом сывороточный белок (ММ=445 тыс Д), он образуется в клетках РЭС и содержит 24 протомера, образующих полую сферу с диаметром полости около 7,5 нм и содержащей до 4300 атомов окисленного железа (в виде окиси и фосфатов), в белковой оболочке имеется 6 каналов, ведущих в полость. Функция ферритина — депонирование железа, в наибольших количествах он содержится в печени, селезенке и костном мозге. Ферритин сыворотки, несмотря на малое его содержание, содержит 20‑25% железа (концентрация ферритина 1 мкг/л сыворотки эквивалентна 8 мг железа в организме).

Определение содержания железа в цельной крови не имеет практического значения, так как определять гемоглобин значительно проще. Состояние обмена железа лучше всего характеризует количество негеминового сывороточного железа, т.е. железо трансферрина и ферритина, являющееся основным резервом организма.

Общее количество трансферрина, связанного с железом и свободного, может быть определено иммунологическими методами, свободный трансферрин можно определить по его способности связывать радиоактивное железо. Содержание ферритина определяется с помощью радиоиммунного анализа. Эти методы весьма чувствительны, специфичны, но требуют специальной аппаратуры и реактивов, а также длительного времени выполнения исследований.

Для определения обеспеченности организма железом можно использовать десфераловую пробу: больному внутримышечно вводится 500 мг десферала (комплексон, избирательно выводящий железо), после чего собирается суточная моча, в которой определяется содержание железа. Снижение концентрации железа в моче свидетельствует о дефиците металла в организме.

Для практических лабораторий наибольшее значение имеет определение негеминового железа сыворотки, а также ее железосвязывающей способности, т.е. того максимального количества трехвалентного железа, которое может связаться с белками сыворотки. Наиболее часто употребимыми методами определения железа сыворотки крови являются:

1. Абсорбционная спектроскопия, при применении этого метода возникают такие трудности, как отсутствие катодной лампы, соответствующей длине волны поглощения атомов железа и наличие интерференции с другими веществами.

2. Колориметрический анализ предполагает проведение нескольких этапов:

• диссоциация железа из комплекса с трансферрином, что достигается снижением pH (оптимальное значение 4,8‑5,0) с помощью органических (обычно уксусной) или неорганических кислот,

• восстановление иона железа (с помощью гидразина, меркаптоацетата, сульфита, гидроксиламина, тиогликолевой и аскорбиновой кислот),

• взаимодействие с комплексоном и формирование железо‑хелатированного хромогенного комплекса.

Комплексон должен удовлетворять следующим требованиям: достаточная специфичность к двухвалентным ионам железа, высокий коэффициент молярного поглощения, максимум поглощения должен находиться в удобном для фотометрии диапазоне волн, хорошая растворимость и устойчивость в водной среде.

В качестве комплексонов предложены ферен‑В, феррозин, батофенантролин. Из множества реакций как на восстановленное, так и на окисленное железо лучшие результаты получаются с батофенантролином, который образует наиболее прочный и яркоокрашенный комплекс. Поскольку батофенантролин нерастворим в воде, то используют его спиртовый раствор, также получают водорастворимое сульфонированное производное батофенантролина путем обработки последнего хлорсульфоновой кислотой. Методы с использованием ферена‑B и феррозина не обладают достаточной специфичностью, так как способны образовывать комплексы с медью (для исключения ее влияния используется тиомочевина).

В качестве унифицированного предложен батофенантролиновый метод.