Наиболее схожие по структуре белки

Модель выбранного белка после «Build Model»

Модель выбранного белка после «Build Model»

Модель выбранного белка после «Build Model»

Вывод: Входе лабораторной работы смоделировали третичную структуру белка, взяв первичную структуру с сайта https://www.ncbi.nlm.nih.gov. Сравнили сходство полученной модели амилазы с известными структурами других организмов. Структуры полученных белков имеют высокое сходство с изначально выбранными образцами.

Короновирус (SARS-CoV-2) проникает к клетки после контакта со специфическим белком (АСЕ2 - ангиотензинпревращающий фермент). Если на поверхности клетки его нет, то вирус не сможет ее инфицировать (подробнее на https://en.wikipedia.org/wiki/Severe_acute_respiratory_syndrome_coronavirus_2#/media/File:SARS-CoV-2_without_background.png ).

На данный момент на ресурсе https://www.expasy.org/ приведены последние актуальные данные по SARS-CoV-2, геном, протеины и др. Особо полезную информацию найдут исследователи, которые методами молекулярного моделирования (in silico) пытаются создать лекарство против вируса. Возможность найти мишени (протеины), на которые будут действовать (связываться) молекулы. В частности, если «заблокировать» АСЕ2 низкомолекулярным лигандом, то это будет препятствовать адсорбции вируса на поверхности клетки, и как следствие этого уменьшать вероятность проникновения его в клетку.

На ресурсе https://www.uniprot.org/uniprot/Q9BYF1 информация про АСЕ2 (ангиотензинпревращающий фермент). Было выяснено, что замена некоторых аминокислотных остатков в АСЕ2 предотвращает связывание с вирусом. Замена К (лизин) на D (аспарагиновая кислота) в положении 31 предотвращает взаимодействие с гликопротеином «шпионом», как и замена тирозина (Y) на аланин (A) (Обведено).

Fasta файл , первичная последовательность аминокислот

>sp|Q9BYF1-2|ACE2_HUMAN Isoform 2 of Angiotensin-converting enzyme 2 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=ACE2

MSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQ

NMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTIL

NTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLY

EEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHL

HAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQ

AWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILM

CTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKS

IGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEM

KREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLH

KCDISNSTEAGQKLL

Если найти соединения, которые будут связываться с остатками аминокислот K31, Y41, D355 и др., то можно надеяться (если не будет побочных эффектов, если фармакокинетические параметры будут приемлемые - ADMET), что получатся препараты для профилактики заражения короновирусной инфекцией.

https://www.ebi.ac.uk/pdbe/entry/pdb/1R42 структура АСЕ2

Для теоретической оценки взаимодействия белка (ACE2) с какой либо молекулой (лиганд) используется т.н. процедура докинга (дословный перевод с англ. – стыковка, причаливание) https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9C%D0%BE%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%83%D0%BB%D1%8F%D1%80%D0%BD%D1%8B%D0%B9_%D0%B4%D0%BE%D0%BA%D0%B8%D0%BD%D0%B3

В большинстве случаев программы для докинга платные, но существуют и бесплатные. В частности на интернет ресурсе expasy.org есть бесплатная (free of charge), общедоступная онлайн программа для молекулярного моделирования (докинга) - SwissDock.

Таким образом, алгоритмом теоретического поиска «возможного лекарства от короны» является:

1. На основании вышеизложенных данных, провести «докинг» ACE2 с какой-либо молекулой. Получить оценку силе взаимодействия и увидеть место «стыковки», т.е. с какими аминокислотными остатками АСЕ2 будет взаимодействовать тестируемая молекула и как сильно.

2. Необходимо найти на ресурсе Pdb.org графическую структуру докируемого белка (или его код) и сохранить в pdb – расширении (например, 1r42.pdb) на рабочий стол.

3. Нарисовать в химическом редакторе (chemdraw или др. доступный) структуру соединения (можно протестировать известные противовирусные препараты или придумать свою собственную молекулярную органическую структуру), и после оптимизации ее методом молекулярной механики (Chem3D) сохранить в mol2 расширении.

База данных Pdb.org содержит информацию о 3D-структуре белка, полученную рентгеноструктурным методом (X-ray) (как правило). Предварительно интересующий белок кристаллизуют из воды. Поэтому в графическом файле помимо самого белка присутствуют молекулы воды (как растворитель) и вспомогательные соединения (глицерин, ионы буферных растворов, ПАВы). Для корректного докинга их необходимо удалить. Поэтому лучше использовать уже подготовленный файл, где в соответствующей программе (все химические редакторы, которые работают с макромолекулами - белками) удалено лишнее (ACE2prep2.pdb). Этот файл загружать в SwissDock, он находится на моей странице!!!

На ресурсе expasy.org в категории proteomics (1) открыть в Tools вкладку (2) и в разделе submit docking в target selection загрузить (с помощью search найти его) с рабочего стола белок ACE2prep2.pdb и в ligand selection также тестируемую молекулу в mol2 формате и указать на английском что-нибудь в окошечке «job name», и электронный адрес, куда придут результаты. Если дождаться результатов on-line, то можно посмотреть их в интерактивной форме. Но обычно результтаты будут готовы на следующий день.

Результатом докинга будут положения лиганда в комплексе с белком и энергия взаимодействия. Чем меньше значение энергии взаимодействия, тем прочнее комплекс.

Вид результатов докинга

Результаты можно сохранить в zip.формате (Download your predictions file).

Для удобного просмотра результатов докинга необходимо скачать и установить программу Chimera. В нашем случае нам важно, чтобы не только энергия связывания (binding) была минимальная, но место связывания находилось около 31, 41 и 355 аминокислотных остатков. Поэтому визуально в JavaSmol мы этого не увидим.

Программа для визуализации результатов докинга и вообще для молекулярного моделирования Chimera для академического использования бесплатная. Ее скачать и установить можно по ссылке «You can get Chimera here» (см. )

Для просмотра результатов, необходимо скачать файл «open. chimarax». (Launch UCSF Chimera to …..) и сохранить в папке, где расположен и zip-файл.

Более полную информацию о том, как работать в «химере», можно найти в YouTube или читать раздел Help.

После установки программы открываем ее и в строке file\open находим и открываем «open. chimarax». Может всплыть предупреждение об угрозе от открытия, мы жмем Yes и тогда откроются 2 окна, с белком и результатами докинга. Для визуального анализа мест связывания необходимо выделить интересующие аминокислотные остатки. В строке Tools - sequence – sequence выделить K31 (лизин), Y41 (тирозин) и D355 (аспарагиновая кислота). Для мультивыделения использовать кнопку Shift.

Результаты докинга группируются в кластеры (что это такое?).

К сожалению, в представленном в качестве примера результат докирования соединения (дикумарол) с белком ACE2 ни в одном случае нет кластеров с близким контактом лиганда с ключевыми аминокислотными остатками (на картинке зеленым выделены остатки лизина, тирозина и аспарагиновой кислоты; лиганд - голубой). Ниже приведены изображения кластеров 21 и 22.

Цели: Найти какое-либо соединение с известными экспериментальными данными по липофильности и растворимости.

Известные данные:

Липофильность – LogP =1,2

Растворимость в воде – 3мг/мл

Различие в липофильности можно объяснить наличием -SO₃H группы и йода.

Вывод: Входе лабораторной работы способна приблизительно предсказать липофильность введенного вещества на основе его структуры.

Ход работы

Условия хроматографирования:

1. Хроматографическая колонка: 150×3,5 мм для хроматографа «Agilent», заполненная сорбентом с размером зерен 3,5 мкм; обращенно-фазовая

2. Режим элюирования: градиентный;

3. Подвижная фаза: ацетонитрил – вода, 0 мин = 100% H₂O, 20 мин = 100% CH₃CN

4. Скорость потока элюента – 1 мл/мин;

5. Детектор – УФ-спектрофотометрический, λ=270 нм;

6. Температура колонки: 25 ⁰С.

7. Объем вводимой пробы – 20 мкл.

Предварительно путем введения водных растворов соединений с известной липофильностью в хроматограф определяют время удерживания, результаты вносят в таблицу 1.

Задание.

1. В программе ChemDraw нарисовать структуру соединения с известной липофильностью, затем в меню View выбрать Show chemical properties window и вставили приведенное значение ln P в таблицу 1 (графа «расчетное»).

2. Построить график зависимости времени удерживания от липофильности.

3. Для аспирина (ацетилсалициловая кислота) рассчитать липофильность по экспериментально найденному времени удерживания (6.8 мин).

4. Для аспирина рассчитать липофильность с помощью программы ChemDraw.

5. Сделать выводы относительно точности предсказания липофильности расчетными методами.

Таблица 1.

Структура	Наименование соединения	Время удерживания (мин)	Липофильность (lnP)
			Расчетное (ChemDraw)	Экспериментальное
	Толуол	10,7	2,5	2,9
	Бензойная кислота	6,073	1,59	1,6
	Дифениламин	12,20	3,5	3,2
	Феноксиуксусная кислота	6,4	2,1	1,71
	п-Нитроанилин	5,65	1,72	1,38
	о-Нитроанилин	7,10	1,01	1,97
	Ацетилсалициловая кислота	6,38	1,18	1,2
	Салициловая кислота	6,92	1,2	2,26

Рис.1. График зависимости времени удерживания от липофильности

Таблица 2. Сравнительные данные

Метод	Ln(P)		Точность расчётных данных относительно экспериментальных, %
	Ацетилсалициловая кислота	салициловая кислота	Ацетилсалициловая кислота	салициловая кислота
ChemDraw	1,18	1,2	42	52
Эксперемен- тальное	1,2	2,26	40	80,9
Расчётное	1,68	1,828

Вывод: В ходе лабораторной работы рассчитали липофильность ацетилсалициловой и салициловой кислот, с помощью графика зависимости времени удержания веществ от экспериментальных значений липофильности. Расчётные значения оказались ближе к значениям полученным экспериментально.

Ход работы:

Оборудование и реактивы

1. Ацетилсалициловая кислота порошок;

2. Салициловая кислота порошок (4-нитроанилин);

3. Гидрохинон (4-нитрофенол) порошок

4. 1-октанол (этилацетат)

5. Стеклянные баночки (пенициллинки) или делительная воронка

6. Плитка лабораторная электрическая

7. Спектрофотометр СФ-102 или аналогичный

8. Хроматограф Agilent Technology 1220 Infinity

9. Дозатор

Расчет липофильности проводят по формуле:

P= lg (D_исх.-D_конечн /(D_{конечн.}),

где D_{конечн.} – значение оптической плотности водного раствора после встряхивания с октанолом. D_исх.- оптическая плотность исходного водного раствора до встряхивания с октанолом.

Таблица 1

Вещество	Длина волны, нм	Оптическая плотность
4-нитроанилин	275	1,2820

Таблица 2.

Вещество	Соотношение		Оптическая плотность в водной фазе		Константа распреде- ления*	Липофильность**
	Водный р-р	1-октанол (этилацетат)	До экстракции	После экстракции
4-нитроанилин	4	1	1,2820	0,4535	7,307	0,8637
* константа распределения рассчитывается по формуле К= , где а – отношение взятого объема водной фазы к взятому объему 1-октанола; ** липофильность рассчитывается как логарифм константы распределения.

Вывод: В ходе лабораторной работы было выяснено, что липофильность 4-нитроанилина составляет 0,8637, поэтому вещество является жирорастворимым.