Ход работы:
Исследуемое соединение:
Сухие дрожжи в количестве 200 мг добавляют в 10 мл воды и оставляют на 30 минут для набухания.
Предварительно готовят субстрат дыхания (водный раствор фумарата или сукцината натрия с pH=7, концентрация 0.4 моль/л). Можно обойтись и без субстратов.
Готовят растворы тест-соединений в ДМСО с концентрацией 10мМ/л в объеме 100 мкл.
В 2 лунки 96 луночного планшета вносят исследуемые вещества в количестве 5 мкл (концентрация веществ 10 мМ в ДМСО) 10 мкл ТФТХ (водный раствор трифенилтетразолий хлорида 10 мл/мг) и 100 мкл тщательно встряхнутой суспензии дрожжей и оставляют до появления отчетливой красно-розовой окраски осевших дрожжей (1-2 часа). В контрольные лунки вместо растворов тест-соединений добавляют по 2 мкл ДМСО. Для учета оптической плотности самих дрожжей вносят суспензию дрожжей (100 мкл ), но не добавляют ТФТХ («нулевая» оптическая плотность).
Измеряют оптическую плотность при λ=490нм на микропланшетном ридере.
Расчет
Находят среднее из двух значений из «нулевой» оптической плотности (D0).
D0 = (1,827+1,758)/2 = 1,7925
Находят среднее из двух значений контрольной пробы:
Dср.к=(2,178+2,154)/2=2,166
и вычитают D0, получают Dконтр.
Dконтр = 2,166 - 1,7925=0,3735
Аналогично из среднего значения оптической плотности исследуемых соединений вычитают D0, получают Dэксп.
Dср.соед= (2,634+2,878)=2,756
Dэксп = 2,756 - 1,7925=0,9635
Процент остаточной активности рассчитывают по формуле: Dэксп.×100/ Dконтр.
Ост.активность = 0,9635*100/0,3735 = 258%
По результатам работы заполняют таблицу 1.
Таблица 1.
Влияние соединений на процесс образование формазана
№ |
Соединение |
Dсреднее |
Количество тест-соединений на массу сухих дрожжей нМ/мг |
Ингибирование (%)
|
1 (шифр 1552) |
|
2,756 |
10/2 |
0 |
|
Контроль |
2,166 |
|
0 |
Вывод: в ходе выполнения лабораторной работы было выяснено, что вещество 2-(2-изопропил-5-метил-4-тиоцианатофенокси)уксусная кислота не ингибирует дыхание дрожжей