МУ Санитарная микробиология

3. Отбор проб методом смыва стерильным тампоном применяют к по-

трошеным тушкам любой массы. Смыв осуществляют с разных участков 2-5 там-

понами, которые помещают в колбу со 100 мл стерильной жидкости и встряхива-

ют в течение 2 мин. Полученная смывная жидкость служит исходным материалом для приготовления последовательных 10-кратных разведений.

Микробиологический анализ проводят на наличие МАФАнМ, БГКП, сальмо-

нелл, сульфитредуцирующих клостридий, протея, золотистого стафилококка.

Перечень контрольных вопросов:

1.При каких условиях проводят бактериологическое исследование мяса.

2.Этапы исследования мяса.

3.Органолептические показатели свежести мяса.

4.Способы обеззараживания условно годного мяса.

5.Для чего применяется среда Кесслера.

Тема 4.2. Освоение методики и проведение микробиологического исследо-

вания колбас

Цель: изучить методы бактериологического исследования колбас и колбас-

ных изделий с целью определения их качества и индикации пищевых токсикозов и токсикоинфекций, а также возбудителей порчи.

Содержание:

отбор проб;

определение количества МАФАнМ в колбасе;

индикация БГКП;

индикация сальмонеллезной палочки;

индикация протея;

индикация стафилококка;

индикация сульфитредуцирующих клостридий (СРК).

Колбасные изделия – продукты переработки мяса, употребляемые в пищу без дополнительной подготовки, т.к. мясо, используемое для их приготовления, под-

121

вергают специальной механической, физико-химической и термической обработ-

ке.

Бактериологическое исследование колбасных изделий направлено на опреде-

ление количества МАФАнМ, БГКП, индикацию сальмонелл, бактерий родов Proteus, микроорганизмов порчи (дрожжи, плесневые грибы).

Отбор проб

Пробы продуктов для микробиологического исследования отбирают раньше проб для физико-химического и органолептического исследований с соблюдени-

ем правил асептики, в стерильную посуду, с применением стерильных инстру-

ментов. Масса пробы установлена научно-технической документацией на кон-

кретный вид продукции, достаточной для проведения полного микробиологиче-

ского анализа.

От кусковой продукции массой нетто до 1000 г отбирают точечные пробы ложкой, пинцетом или другими инструментами в зависимости от вида и размера куска и помещают в посуду или упаковывают в фольгу. Пробы скоропортящихся продуктов транспортируют при температуре 5 °С не более 6 часов.

От кусковой продукции массой нетто более 1000 г пробы отбирают одним из следующих методов:

-отрезают или вырезают часть продукта ножом или пилой;

-продукт в нескольких местах режут ножом и с поверхности данного разреза

ииз глубины продукта скальпелем берут необходимое количество кусков, кото-

рые в стерильную посуду переносят в стерильную посуду;

- срезают поверхностный слой продукта толщиной от 0,5 до 1 см ножом, при помощи буравчика или зонда и выдавливают продукт в посуду. При отборе пробы из глубины продукта его просверливают в разных местах не менее чем до поло-

вины высоты.

Каждую отобранную пробу маркируют этикетками с указанием необходимых данных, пломбируют, опечатывают и транспортируют в лабораторию.

Из объединенной пробы каждого образца берут в стерильную посуду (или пергаментную бумагу) навесок массой 20 г, который помещают в стерильный

122

стакан гомогенизатора, добавляют 4-кратное количество стерильного физиологи-

ческого раствора и гомогенизируют. В результате в 1 мл приготовленной взвеси содержится 0,2 г исследуемого продукта. Взвесь 15 минут выдерживают при ком-

натной температуре и делают высев для определения количества МАФАнМ,

БГКП, бактерий рода сальмонелла и протея, сульфитредуцирующих клостридий.

Методика определения МАФАнМ. Из каждой пробы колбасных изделий де-

лают не менее двух различных по объему посевов, взятых с таким расчетом, что-

бы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. В одну чашку Петри вносят 0,1 г, в

другую – 0,01 г продукта.

Предварительно готовят первое 10-кратное разведение исследуемой взвеси.

Стерильной пипеткой переносят 0,5 мл приготовленной взвеси в пробирку с 5 мл стерильного физиологического раствора (разведение 1:10). Другой стерильной пипеткой содержимое пробирки тщательно перемешивают, затем набирают 1 мл и вносят в стерильную чашку Петри (посев 0,1 г продукта).

Для посева 0,01 г продукта готовят второе разведение – 1:100. Для этого сте-

рильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое пробирки с первым раз-

ведением, набирают 1 мл и переносят в пробирку с 9 мл стерильного физиологи-

ческого раствора и вносят в стерильную чашку Петри (0,01 г продукта). Жидкости тщательно распределяют по обеим чашкам для роста изолированных колоний.

Чашки помещают в термостат и через 2 дня подсчитывают общее количество ко-

лоний, выросших на чашке, умножают на степень разведения исследуемого про-

дукта по каждой чашке и выводят среднее арифметическое результатов подсчета двух чашек с разной массой посеянного материала.

Методика индикации БГКП проводят по общепринятой методике с исполь-

зованием сред, содержащих углеводы (лактоза, глюкоза) – среда Хейфеца, ХБ,

Кода, Кесслера. БГКП ферментируют глюкозу и лактозу, поэтому в перечислен-

ных средах образуются кислые продукты, меняющие цвет индикатора, а в среде Кесслера можно наблюдать появление в поплавках пузырьков газа (без измене-

ния цвета среды).

123

Для выявления БГКП в пробирки с 5 мл среды ХБ или Хейфеца вносят по 5

мл исследуемой взвеси стерильной пипеткой с широким концом. Допускается применение среды Кесслера по 10 мл. Посевы термостатируют при 37 °С 18 -20 ч.

Посевы смывов, отобранных тампонами с поверхности изделий без оболочки, вы-

держивают при 43 °С для повторного бактериального загрязнения. При росте БГКП среда ХБ окрашивается в желтый цвет, среда Хейфеца – в салатно-зеленый,

на среде Кесслера в поплавках образуется газ без изменения цвета среды.

Для окончательного заключения о присутствии в колбасе БГКП проводят вы-

сев со среды Кесслера (из забродивших проб) или Хейфеца (если произошло из-

менение цвета среды) в чашки Петри со средой Эндо (Плоскирева, Левина), кото-

рые помещают в термостат при 37 °С на 18-20 ч. На среде Эндо БГКП образуют темно-красные колонии с металлическим блеском, на среде Плоскирева – кир-

пично-красные, на среде Левина – темно-фиолетовые. Из колоний, в которых по-

дозревают наличие БГКП, готовят мазки и окрашивают по Граму для обнаруже-

ния грамотрицательных палочек.

Среды для индикаций БГКП:

1. Среда Хейфеца – розоловая ки-

слота, раствор метиленового синего,

вода, пептон, маннит, хлорид натрия.

Готовая среда красно-фиолетового цвета, при росте кишечной палочки рН сдвигается в кислую сторону, и среда

приобретает зеленоватую окраску (ри-

124

магниевой) или 225 мл селенитового бульона. Флакон встряхивают и помещают в термостат при 37 °С, через 24 ч петлей или пастеровской пипеткой проводят по-

сев из среды обогащения в чашки Петри со средой Эндо, Плоскирева, Левина или ВСА. Посевы помещают в термостат при 37 °С на сутки.

На среде Эндо, Плоскирева, Левина бактерии из рода сальмонелл образуют бесцветные колонии. На ВСА сальмонеллы образуют черные или коричневые ко-

лонии с металлическим блеском, при этом участок среды под агаром чернеет. Не менее 5 изолированных, характерных для сальмонелл, колоний пересевают на трехсахарный агар (37 °С, 12-16 часов), где при росте сальмонелл цвет скошенной поверхности розовый, столбик – желто-бурый. Газообразование устанавливают по наличию трещин и разрыву столбика агара, при образовании сероводорода пита-

тельная среда чернеет.

Другие грамотрицательные бактерии семейства энтеробактерий дают сле-

дующие изменения цвета трехсахарногоагара:

- БГКП окрашивает среду в синий или сине-зеленый цвет с образованием газа или без него;

125

- палочка протея окрашивает среды в ярко-красный цвет (вследствие расщеп-

ления мочевины), в случае выделения H2S может появиться черный осадок с воз-

можным разрывом агара.

Для дальнейшей идентификации бактерий готовят мазки и окрашивают по Граму, микроскопируют, изучают антигенные свойства путем постановки РА на предметном стекле с поливалентной сальмонеллезной агглютинирующей сыво-

роткой. Далее проводят идентификацию с помощью монорецепторныхО- и Н-

агглютинирующих сальмонеллезных сывороток.

Индикация протея в Н-форме про-

водится внесением исследуемого про-

дукта в конденсат свежескошенного МПА (метод Щукевича). Посевы поме-

щают в термостат на сутки при кке37 °С.

При наличии в исследуемом продукте протея подвижная палочка поднимается вверх по скошенной поверхности агара,

образуя вуалеобразный голубоватый на-

лет (рисунок 59). Культура издает харак-

терный гнилостный запах. Это поли-

морфные подвижные грамотрицательные палочки, сбраживают глюкозу и мочеви- Рисунок 10 - Рост палочки протея.

ну, не ферментируют лактозу и маннит.

Индикация стафилококка. Основана на изучении морфологии, культураль-

ных свойств и способности некоторых стафилококков ферментировать лецитина-

зу и коагулировать цитратную плазму крови кролика под воздействием фермента коагулазы.

Вначале исследуемый продукт разводят 1:10, вносят МПБ, содержащий 6,5 %

натрия хлорида. Через сутки после инкубирования в термостате проводят посев на молочно-солевой агар для изучения наличия пигмента и на желточно-солевой агар для выявления лецитиназной активности (рисунок 60).

126

взаимодействии натрия сульфита с хлоридом железа образуется сульфат железа,

который вызывает почернение питательной среды. 1 мл исследуемой взвеси

стерильной пипеткой вносят в пробирку 9 мл жидкой сульфит-циклосериновой среды или среды Вильсон-

Блера. Затем проводят после-

довательные пересевы на аналогичные объемы среды и получают возрастающие 10-

кратные разведения суспен-

зии. Выдерживают сутки при

37 °С при наличии СРК среда чернеет (рисунок 61).

Для подтверждения при-

надлежности выделенных

агаризованной плотной среды Вильсон-Блера и инкубируют в анаэробных усло-

виях при 37 °С 1-2 дня. Отбирают типичные колонии и изучают микроорганизмы по морфологическим и некоторым культурально-ферментативным свойствам, в

частности, по отрицательной реакции на каталазу.

Если в посевах (в 4 колониях из 5) обнаружены СРК, спорообразующие палочки,

грамположительные, каталаза-отрицательные, способные расти в анаэробных ус-

ловиях, то делают заключение о наличии в продукте СРК по максимальному раз-

ведению суспензии, в посеве которого наблюдается почернение среды.

128

Перечень контрольных вопросов:

1. Особенности отбора проб колбасы для бактериологического исследова-

ния.

2.Какие группы микроорганизмов можно идентифицировать в колбасных изделиях.

3.Элективные среды для культивирования БГК.

4.Для чего используют желточно-солевой агар.

5.Метод Шукевича.

6.Какие колонии образуются на маннито-солевом агаре.

Тема 4.3. Микробиологические исследования яиц и яйцепродуктов

Цель: изучить методы бактериологического контроля качества яиц и яйце-

продуктов.

Содержание:

отбор проб;

определение общей бактериальной обсемененности;

определение количества МАФАнМ;

индикация БГКП;

индикация сальмонеллезной палочки;

бактериологическое исследование яичных продуктов.

Санитарно-микробиологическому контролю подвергают поступающее сырье

(яйца куриные), готовые продукты: яичный меланж и яичный порошок.

Яйца для микробиологического анализа отбирают из разных мест партии ме-

тодом случайной выборки в количестве 30 штук. Обобранную пробу упаковывают в чистую тару и транспортируют в условиях, исключающих их повреждение и вторичную контаминацию (загрязнение).

Особенность санитарно-микробиологического исследования яиц и продуктов их переработки заключается в одновременном исследовании микрофлоры на по-

верхности скорлупы и в содержимом яйца.

129

При микробиологическом исследовании поверхности скорлупы яиц делают смывы:

- методом использования тампона в ступку, содержащую 10 мл стерильно-

го физиологического раствора, погружают яйцо и с помощью стерильного тампо-

на обмывают наружность яйца 2 – 3 мин, полученный смыв исследуют;

- методом ополаскивания в стерильную посуду или полиэтиленовый пакет наливают 10 мл стерильной жидкости, в которую погружают яйцо и встряхивают

5мин. Полученный смыв исследуют;

-методом измельчения скорлупу и подскорлупную оболочку от трех яиц отделяют от содержимого и помещают в стерильные ступки. Содержимое расти-

рают пестиком, заливают 90 мл стерильной жидкости. После 3-5 мин оттаивания надосадочную жидкость исследуют без разведения или готовят 10-кратные разве-

дения в зависимости от степени загрязнения поверхности скорлупы.

Общую бактериальную обсемененность поверхности яиц (количество МА-

ФАнМ) определяют путем посева 1 мл смыва или его 10-кратных разведений па-

раллельно в две чашки Петри, равномерно распределяют, культивируют при 30 °С

2-3 дня. Подсчитывают все колонии, выросшие в глубине и на поверхности плот-

ной питательной среды, определяют среднее арифметическое число колоний по двум чашкам одного разведения, умножают на величину разведения и делят на площадь поверхности скорлупы яиц (ее высчитывают по другой формуле). В ре-

зультате получают количество микроорганизмов (КОЕ/см2) на 1 см2 скорлупы яиц.

Перед микробиологическим исследованием содержимого яиц поверхность скорлупы обмывают теплым 0,2 %-ным раствором каустической соды или 0,5 %-

ным раствором кальцинированной соды в течение 2 мин. После мойки яйцо опо-

ласкивают водопроводной водой, дают стечь и погружают в 70 %-ный спирт на 10

мин, после чего обжигают в пламени.

На остром конце яйца делают отверстие диаметром около 1 см и снова обжи-

гают. Содержимое одного или нескольких яиц выливают в колбу и гомогенизи-

130