МУ Микробиология Лабораторные

По феномену взаимодействия антигена с антителом выделяют реакции оса-

дочные, лизирующие и нейтрализующие. Антитела, участвующие в данных реак-

циях: агглютинины – вызывают агглютинацию и осаждение комплекса; преципи-

тины – образуют преципитат с растворимым антигеном. В реакциях лизиса участ-

вуют бактериолизины и гемолизины (лизируют антиген). Нейтрализующие анти-

тела обезвреживают, нейтрализуют токсическое действие антигена.

При постановке серологических реакций один из компонентов всегда изве-

стен. Компоненты разводят на физиологическом растворе.

РА является серологической (serum - сыворотка). В основе всех серологиче-

ских реакций лежит спе-

цифическая реакция меж-

ду антителом и антигеном.

Сущность РА заклю-

чается в том, что при до-

бавлении сыворотки (со специфическими антите-

лами) к равномерной взве-

си антигена происходит их склеивание (глыбки, ко-

мочки, хлопья), постепен-

но оседают на дно пробир-

ки, формируя агглютинат,

жидкость над ним просвет- Рисунок 69 - Реакция агглютинации.

ляется (рисунок 69). Характер агглютината зависит от антигенного строения мик-

робной клетки (антигена). Если антигеном является взвесь неподвижных бактерий

(без жгутиков), имеющих только соматический О-антиген, образуется мелкозер-

нистый осадок в течение 16-22 ч. Если антигеном служит взвесь бактерий, имею-

щих жгутики (подвижные виды), и в агглютинации участвует наряду с соматиче-

ским еще жгутиковый Н-антиген, формируется крупнохлопчатый, крупнозерни-

стый агглютинат.

81

В ветеринарной практике РА используют для диагностики бруцеллеза, саль-

монеллезов, колибактериоза, листериоза, вибриоза, лептоспирозов и других забо-

леваний.

Существует несколько методов постановки РА.

Для определения антител (по известному антигену) берут 5-10 мл крови из яремной вены животного (у свиней из хвостовой) в стерильные пробирки и поме-

щают в теплое место. После образования сгустка осторожно (стерильно!) отделя-

ют его от стенок пробирки, обводя металлической проволокой (вязальной спицей),

и ставят в холодное место для ретракции (отделения) сгустка. Сыворотку отсасы-

вают в стерильные пробирки, нумеруют их, с нарочным и препроводительным письмом отсылают в лабораторию. Используют свежие сыворотки без гемолиза или консервированные фенолом, мертиолатом натрия или борной кислотой. Анти-

ген для РА представляет собой взвесь в физиологическом растворе убитых или живых бактерий. Для диагностических целей рекомендуется стандартный антиген биофабричного производства. Если же необходимо идентифицировать бактери-

альную культуру, выделенную из патологического материала, применяют стан-

дартные сыворотки, а антиген готовят из суточной культуры - смыва с МПА. Спе-

цифические стандартные агглютинирующие сыворотки получают на биофабриках путем гипериммунизации животных соответствующим антигеном (специально подлогов ленной взвесью живых или убитых микробов, эритроцитами и др.). Го-

товую сыворотку консервируют, разливают и ампулы и запаивают. Нередко диа-

гностические сыворотки подвергают лиофильному высушиванию. Перед употреб-

лением такие сыворотки разводят дистиллированной водой. Но для постановки реакции (и промывания пипеток) ее разводят физиологическим раствором.

Постановка РА классическим (пробирочным) методом. Исследуемые сы-

воротки разводят в чистых сухих пробирках с ровным сферическим дном. Для каждой сыворотки берут отдельную пипетку. В зависимости от инфекции произ-

водят соответствующие степени разведения сывороток (согласно инструкции).

Например, для диагностики бруцеллеза сыворотки разводят 1:25, 1:50, 1:100,

1:200, 1:400.

82

Удобно разведения производить следующим образом. В отдельной пробирке готовят основное (исходное) разведение сыворотки - 1:25, смешивая 0,1 мл испы-

туемой сыворотки с добавлением 2,4 мл физ.раствора. В опытные пробирки раз-

ливают по 1 мл физ.раствора. Затем из исходного разведения 1 мл жидкости пере-

носят в первую опытную пробирку, смешивают с физраствором (разведение 1:50)

и 1 мл переносят во вторую пробирку (1:100), из второй 1 мл - в третью и т. д. Из последней пробирки 1 мл выливают в сливную чашку, чтобы и каждой пробирке осталось по 1 мл разведенной сыворотки. Во все пробирки добавляют по две кап-

ли стандартного антигена (концентрация 10 млрд. микробных тел в 1 мл), смеши-

вают встряхиванием и выдерживают в термостате 4-6 ч при 37 °С, а затем при комнатной температуре 14-16 ч.

При постановке РА (как при каждой серологической реакции) обязательны контроли: в тех же разведениях испытывают сыворотку нормальную (от здорово-

го животного) и позитивную (от заведомо больного животного или стандартную биофабричного производства) с тем же антигеном.

Для контроля антигена в 1 мл физиологического раствора добавляют две кап-

ли антигена для исключения самоагглютинации.

Учет РА проводят невооруженным глазом, начиная с контрольных пробирок.

Результат РА принято выражать количеством крестов:

++++ (#) - полное просветление жидкости, образовавшийся агглютинат в виде перевернутого зонтика, при встряхивании разбивается в глыбки, хлопья разной величины, жидкость остается прозрачной;

+++ ( ) - неполное просветление жидкости, характер агглютината, как и в предыдущем, в виде зонтика, при встряхивании разбивается на более мелкие глыбки, комочки;

++ ( ) - обозначают РА неполную, с неполным просветлением жидкости, аг-

глютинат в виде зонтика, но при встряхивании разбивается на хлопья разной ве-

личины, жидкость мутная;

83

+ - наличие небольшого нехарактерного осадка в виде «пуговки», жидкость над ним мутная. При встряхивании такой осадок легко разбивается, увеличивая мутность;

- (минус) - вся жидкость в пробирке мутная, на дне пробирки небольшой оса-

док антигена с ровными краями в виде «пуговки» и при встряхивании разбивается в равномерную муть.

3-4 креста - положительная РА;

2 креста – сомнительная;

1 крест или его отсутствие – отрицательный результат.

производят учет. Для ускорения реакции стекло слегка подогревают высоко над пламенем горелки. Положительный результат проявляется образованием в капле сыворотки комплекса антиген-антитело в виде крупинок, хлопьев, жидкость ста-

84

новится прозрачной. При отрицательном результате капля смеси сыворотки и ан-

тигена остается равномерно мутной (отсутствие в сыворотке антител).

Кровяно-капельный метод РА чаще применяют для диагностики пуллороза

(сальмонеллеза птиц) и бруцеллеза. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю цельной крови (взятой у птиц из гребешка или сережки), в нее добавляют каплю соответствующего антигена и смешивают стеклянной палочкой. Для луч-

шей видимости феномена агглютинации биопромышленность выпускает антиген,

подкрашенный гематоксилином. В положительных случаях РА через 30-60 с. в

капле смеси появляются глыбки, хлопья склеенного антигена (агглютинат).

молоке имеются антитела, образуется комплекс антиген-антитело, который ад-

сорбируется на капельках жира и при отстаивании всплывает наверх, образуя си-

нее кольцо в нижнем слое сливок; столбик молока обесцвечивается. От-

рицательная реакция характеризуется синей окраской всего молока в пробирке и слегка желтоватым слоем единиц (рисунок 71).

Реакция Кумбса. Прямая реакция Кумбса заключается в том, что к эритроци-

там больного животного добавляют специфическую антиглобулиновую сыворотку

(содержащую антитела против глобулинов сыворотки). Эритроциты агглютини-

руют. При непрямой реакции Кумбса сыворотку больного животного соединяют с эритроцитами здорового, а затем добавляют антиглобулиновую сыворотку. Бло-

85

кирующие антитела соединяются с эритроцитами и добавленная антиглобулино-

вая сыворотка, вступая в реакцию с неполными антигенами, приводит к агглюти-

нации эритроцитов, нагруженных блокирующими антителами.

Контрольные вопросы:

1.В чем сущность серологических реакций.

2.Можно ли использовать РА для идентификации бактерий.

3.Перечислить модификации РА.

4.Диагностическая оценка реакции агглютинации.

Тема 2.2. Реакция преципитации

Цель занятия: ознакомить студентов с техникой постановки реакции преци-

питации; постановкой трех вариантов реакции преципитации: в плотной среде – диффузная преципитация (РДП), в жидкой среде – кольцепреципитация (РКП),

диск-преципитация (Р ДискП).

Содержание:

1.РП.

2.РДП.

3.РдискП.

РП - от лат. praecipilo

осаждать. При соединении антигена (преципитиноге-

на) со специфическими ан-

тителами (преципитинами)

образуется осадок (преци-

питат). Используют анти-

гены растворимые, полу-

Рисунок 72 - Реакция преципитации.

чаемые путем экстракции из разрушенных бактерий или извлеченные из тканей. Постановку реакции осу-

ществляют в пробирках Уленгута.

86

Реакция кольцепреципитации (по Асколи). В качестве антигена служит фильтрат живой или убитой нагреванием микробной культуры или экстракт из ис-

следуемого материала (выдерживают в течение суток и фильтруют до полной про-

зрачности). В качестве антитела используют специфическую сыворотку фабрич-

ного производства.

В узкие пробирки Уленгута наливают 0,3-0,4 мл сыворотки (антитела). Ан-

тиген осторожно наслаивают по стенке пробирки в объеме 0,3-0,4 мл. Нельзя до-

пустить перемешивания! При положительном результате на границе двух жидко-

стей образуется белое кольцо (преципитат - осадок). Реакция представлена на ри-

сунке 72.

Реакция диффузной преципитации (РДП).В слое агарового геля делают несколько лунок, в которые на-

ливают антигены и сыворотки так, чтобы они находи-

лись соседних лунках. Из лунок антигены и сыворотки начинают диффундировать в слой геля во все стороны от каждой лунки. Если они окажутся гомологичными,

ния в виде беловатой полосы преципитации (рисунок 21), которая хорошо заметна на фоне прозрачного геля. Если же

диффундирующие друг другу навстречу антиген и сыворотка него-

мологичны, полосы преципитации не

образуется.

87

Реакция флокуляции (по Рамону) (от лат. f1оecus - хлопья) - появление опа-

лесценции или хлопьевидной массы в пробирке при реакции токсин – антитоксин

(рисунок 74). Ее применяют для определения активности антитоксической сыво-

ротки или анатоксина. В пробирки, содержащие по 10 мл определенного токсина,

добавляют убывающее количество специфической токсину антитоксической сы-

воротки (1,0; 0,9; 0,9; 0,8 и т.д.). Пробирки встряхивают и оставляют при комнат-

ной температуре. Через определенное время наблюдается опалесценция, помутне-

ние, выпадает осадок. Это инициальная флокуляция, сначала она появляется в от-

дельных пробирках, а затем и в соседних с ними.

Контрольные вопросы:

1.В чем сущность реакции преципитации.

2.Как ставят, учитывают и оценивают реакцию преципитации по Асколи.

3.Как ставят реакцию диффузной преципитации.

4.Как ставят реакцию диск-преципитации.

5.Учет результатов в РДП.

Тема 2.3. Реакция связывания комплемента

Цель занятия: ознакомить студентов с компонентами, входящими в состав РСК; с сущностью и условиями, необходимыми для постановки РСК; освоить тех-

нику постановки РСК.

Содержание:

1.РСК.

2.РДСК.

Сущность РСК заключается в том, что при внесении в пробирку бактериоли-

тической системы - трех компонентов (антигена, специфического антитела и ком-

племента) происходит связывание комплемента комплексом антиген + антитело.

Если антиген и антитело не соответствуют друг другу, связывание комплемента не наступает, и он остается свободным. Видимых изменений в пробирке в бактерио-

литической системе не отмечают ни в случае связывания, ни в случае отклонения комплемента. Поэтому в дополнение вводят в качестве индикатора гемолитиче-

88

скую систему - эритроциты барана и специфический гемолизин против последних

(сыворотка кролика, иммунизированного против эритроцитов барана). Если в бак-

териолитической системе комплемент связался (положительный результат), гемо-

лиза эритроцитов не произойдет, т.к. гемолизин может лизировать эритроциты лишь с помощью комплемента. Если в первой системе не произошло связывания комплемента (отрицательный результат), то наступает гемолиз эритроцитов, т.к.

оставшийся свободным комплемент используется гемолизином для осуществле-

ния своей гемолитической функции (рисунки 75, 76).

Компоненты реакции:

I. Бактериолитическая система

1.Антитела

-исследуемые сыворотки (присылают из хозяйств от обследуемых живот-

ных), они должны быть свежими, прозрачными, негемолизированными, допусти-

мо использовать консервируемые. Сыворотка предварительно инактивируется 30

минут при 36 °С для разрушения собственного комплемента;

- диагностические сыворотки (положительная бруцеллезная и отрицательная сыворотки крови) их готовят на биофабриках.

2.Антиген – биофабричный бруцеллезный антиген единый для РА, РСК и РДСК – гомогенная 10 млрд. взвесь инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл в физиологическом растворе.

3.Комплемент – неспецифическая сложная многокомпонентная система термолабильных белков крови, фактор литического действия, содержащийся в свежей сыворотке крови любого животного и человека, а в наибольшем и более постоянном количестве – в сыворотке крови самцов морской свинки. Активирует-

ся при наличии комплекса антиген-антитело. Отдельно с антигеном или антителом не взаимодействует. В ходе реакции антиген-антитело-комплемент образуются компоненты разрушающие клетку (бактериальную, соматическую и др.), которая является антигеном. Такое разрушение антигенов под влиянием антител и ком-

племента называется иммунным лизисом. Используют комплемент, полученный в лаборатории или биофабричный (жидкий либо лиофильно высушенный). В связи с

89

тем, что для постановки РСК комплемент берут в строго определенных количе-

ствах, только на одну систему, его предварительно титруют. При избытке компле-

мента, он может участвовать в обеих системах реакции, что приведет к ошибке в постановке диагноза.

Рисунок 75 - РСК (принцип).

90