МУ Микробиология Лабораторные

харный агар Олькеницкого). При расщеплении мочевины среды окрашиваются в малиновый цвет (Proteusvulgaris, Pseudomonasaeruginosa).

Мясо-пептонный желатин используют для изучения протеолитических свойств микроорганизмов. Культуры мик-

робов, обладающих ферментом желатиназой, вызывают раз-

жижение питательной среды. При этом микробы с аэробным типом дыхания разжижают МПЖ сверху, факультативные – по линии укола «чулком», анаэробы – на дне пробирки.

Микробы со слабовыраженными протеолитическими свой-

ствами в МПЖ образуют от линии посева едва заметные бо-

ковые отростки. При этом такой рост у аэробов характери-

зуют как «елочка верхушкой вниз», у факультативных анаэ-

робов – рост в виде «ламповой щетки», а анаэробы растут в

виде «елочки верхушкой вверх». Микробы с отсутствием Рисунок 58 - Разжи-

жение желатина.

71

протеолитических ферментов растут в МПЖ, не изменяя ее: аэробы – в виде кноп-

ки на поверхности среды, факультативные – растут по укол, анаэробы – на дне пробирки. Культивирование проводят при 22 °С (рисунок 58).

Посев в молоко позволяет определить у микроба наличие фермента казеазы.

При наличие казеазы происходит гидролиз казеина до образования пептонов. Это вызывает просветление среды и носит название пептонизация молока.

Протеолитические свойства у анаэробов определяют по почернению мозго-

вой среды.

Определение сахаролитических свойств микробов

Свойство расщеплять углеводы и многоатомные спирты (сахара) присуще многим микроорганизмам. Под действием сахаролитических ферментов сахара расщепляются на альдегиды и кислоты. Конечными продуктами их расщепления являются углекислый газ и вода. Различные микробы обладают разной способно-

стью расщеплять сахара. Одни микробы расщепляют сахара до конечных продук-

тов, другие только до кислот. Эти свойства учитывают при определении вида микроба (рисунок 59).

В средах Гисса расщепление сахара до промежуточных продуктов (кислот)

определяют по покраснению среды, до конечных продуктов (газов) – по накопле-

нию пузырьков газа в специальных газовичках, помещенных в среду. При отсут-

ствии ферментации сахара рост микробов выражается в равномерном помутнении среды без изменений цвета.

В полужидком агаре с индикатором ВР (водный голубой или розовая кис-

лота) о расщеплении сахаров до кислот судят по изменению цвета среды с серо-

розового до голубого. Образующийся при расщеплении сахара газ накапливается в толще среды.

72

Рисунок 59 - Биохимические свойства микроорганизмов.

На среде Эндо в результате расщепления лактозы, входящей в состав этой

среды, происходит восстановление цвета индикатора основного фуксина, в ре-

73

зультате чего выросшие колонии микробов окрашиваются в красный цвет. Анало-

гично учитывают результаты на средах Левина и Плоскирева. Лактозоположи-

тельные колонии окрашиваются на этих средах в цвет индикатора: в фиолетовый или черный на среде Левина, в розовый на среде Плоскирева. Лактозоотрицатель-

ные не окрашиваются.

В молоке при расщеплении микробом лактозы, т.е. при наличии у него фер-

мента лактазы, происходит свертывание в результате накопления кислых продук-

тов.

Определение окислительно-восстановительных ферментов

Вкультуре микробов важно определить наличие окислительно-

восстановительных ферментов, связанных с функцией дыхания. Диагностическое значение имеет наличие у микробов оксидазной и каталазной активности, а иногда

– рецидирующей способности.

Определение оксидазы проводят несколькими методами, например по Кова-

чу. В этом случае на поверхность колоний суточной агаровой культуры наносят несколько капель реактива Ковача, содержащего диметилпарафенилендиамин. Че-

рез несколько секунд оксидазоположительные колонии окрашиваются в темно-

красный (пурпурный) цвет. Оксидазоположительная – синегнойная палочка, окси-

дазоотрицательная – кишечная палочка, сальмонелла.

Определение каталазы. В культуру вносят 1-2 мл 3 % перекиси водорода.

При наличии у микроба каталазной активности происходит пенообразование в ре-

зультате расщепления перекиси водорода под действи-

ем каталазы на кислород и воду. Каталазной активно-

стью, например, обладают листерии и кампилобактеры.

Не обладают – стрептококки.

Определение редуцирующих свойств

Редуцирующие свойства – способность бактерий

восстанавливать одно соединение в другое, например, соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой Рисунок 60 - Определе-

тельную среду, содержащую органическую краску (лакмусовою настойку, мети-

леновый синий, нейтральный красный и др.). При наличии у микроба ферментов дегидраз происходит отщепление водорода от субстрата и присоединение его к краске, в результате краситель восстанавливается и превращается в бесцветное со-

единение. По обесцвечиванию краски в присутствии микроба судят о редуцирую-

щих свойствах исследуемой культуры (рисунок 60). Например, этим свойством обладают листерии и не обладает возбудитель рожи свиней, что учитывают при их дифференциации.

Определение гемолитических свойств

Проводят с целью определения вида и для дифференциации от непатогенных микробов на кровяном агаре (рисунок 61). При наличии у микроба гемотоксина вокруг колонии образуется зона гемолиза. Различают α-гемолиз, при котором во-

круг колоний наблюдают непрозрачную зеленоватую зону свидетельствующую о

неполном расщеплении гемоглобина эритроцитов и β-

гемолиз, характеризующийся полным растворением эритроцитов, зона вокруг колонии прозрачная.

Например, патогенные стафилококки обладают β-

ных средах.

4.Каков может быть характер роста на жидких питательных средах.

5.Как определить протеолитическую активность микроорганизмов.

6.Как определить сахаролитическую активность.

75

Тема 1.9. Изучение действия антибиотиков, антисептиков и бакте-

риофагов на микроорганизмы.

Цель занятия: изучить антимикробный спектр действия антибиотиков; дей-

ствие антисептиков и бактериофагов на микроорганизмы.

Содержание:

1.Действие антибиотиков на микроорганизмы.

2.Действие антисептиков на микроорганизмы.

3.Действие бактериофагов на микроорганизмы.

В настоящее время есть много антибиотиков, имеющих свой антимикробный спектр действия. Чувствительность микробов к антибиотику может снизиться или совсем исчезнуть за счет появления резистентных вариантов у данного вида мик-

роба. Поэтому при назначении антибиотиков больным необходимо определить степень чувствительности к ним возбудителя с целью подбора самого эффектив-

ного средства.

Метод диффузии антибиотиков в агар с применением дисков

Метод основан на формировании зоны задержки роста микроорганизмов во-

круг бумажного диска, пропитанного антибиотиком, на плотной питательной сре-

де.

Биологическая промышленность выпускает диски из фильтровального карто-

на диаметром 6 мм, пропитанные растворами антибиотиков определенной концен-

трации. Диски с различными антибиотиками отличаются друг от друга по цвету картона или кода, который представляет собой две-три буквы из названия анти-

биотика, вытесненные на диске. Диски фасуют во флаконы по 100 штук. Учитывая гигроскопичность некоторых антибиотиков, на дно флакона помещают силика-

гель, вещество, быстро поглощающее влагу и меняющий при этом свою окраску с синей на розовую. Изменение цвет силикагеля является показателем присутствия влаги во флаконе. Диски из флаконов, в которых силикагель окрашен в розовый цвет, использовать нельзя. После вскрытия флаконов диски можно хранить в условиях холодильника в течение срока. Указанного на этикетке набора. Перед использованием флаконы с дисками необходимо выдержать при комнатной тем-

76

пературе в течение 1 часа для предотвращения образования конденсата на внут-

ренней поверхности флаконов.

Для получения достоверных результатов используют стандартные среды,

диски и условия проведения исследования.

Для определения чувствительности применяют следующие питательные сре-

ды:

- среда АГВ (Андреева, Гивинталь, Гриднева, Ведьмина) – сухая готовая сре-

да, в состав которой входит питательный бульон, порошок агара, лизат кормовых

дрожжей, крахмал растворимый, натрия фосфат двузамещенный;

- диагностический агар ДОИ – рекомендованная ВОЗ сухая готовая среда.

Для микроорганизмов, не растущих на обычных питательных средах, в среды до-

бавляют 5 % дефибринированной крови.

Расплавленные среды разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри. Глуби-

на агарового слоя в чашках должна составлять 3-4 мм. После застывания агара их подсушивают при комнатной температуре 30-40 минут с приоткрытыми крышка-

ми. Готовые чашки со средой можно хранить при 10 °С не более 7-10 дней.

Для посева используют 12-20 часовые агаровые культуры исследуемых мик-

робов, которые смывают физиологическим раствором и по стандарту мутности го-

товят одномиллиардную взвесь. Для посева можно использовать также чистую 20-

часовую бульонную культуру.

На поверхность питательной среды наливают 1 мл взвеси культуры и покачиванием чашки равномерно распределяют ее по всей поверхности. Излишек жид-

биотиками раскладывают стерильным пинцетом на поверхность засеянной среды на одинаковом расстоянии друг от друга и на расстоянии 2 см от края чашки. На одну чашку следует помещать не более 6 дисков для диффузии антибиотиков в агар чашки выдерживают в течение 2 часов при комнатной температуре, а затем помещают в термостат при 37 °С вверх дном.

Результаты учитывают через 16-18 часов по величине зоны задержки роста микробов вокруг диска (рисунок 62). Чашки помещают вверх дном на темную ма-

товую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал на них под углом 45 °. Определяют диаметр зоны с помощью линейки, штангенциркуля или миллимет-

ровой бумаги с учетом диаметра самого диска, с точностью до 1 мм. При диаметре зон в 15-25 мм микробы следует считать чувствительными к антибиотику, при зоне до 15 мм – малочувствительны, отсутствие зон задержки роста указывает на нечувствительность культуры к данному антибиотику. При не резко очерченных краях зон или зонах с двойными контурами следует измерять диаметр зоны по наиболее четкому контуру, не принимая во внимание мелкие колонии или едва заметный газон у края колонии.

Метод серийных разведений антибиотика

Сущность данного метода заключается в выявлении роста исследуемой куль-

туры в питательной среде, содержащей разные концентрации антибиотика. Метод серийных разведений позволяет определить минимальную концентрацию анти-

биотика, ингибирующую рост изучаемого микроорганизма.

При выборе питательной среды учитывают, что она должна обеспечить опти-

мальный рост исследуемой культуры микроба. Чаще всего применяют МПБ; буль-

он Хоттингера, с содержанием 180-200 мг % аминного азота; 2 % МПА. Для ис-

следования анаэробных бактерий используют среду Китта-Тароцци без кусочков печени с добавлением 0,5 % глюкозы. Для серийного разведения антибиотика в пробирки наливают по 2 мл среды для аэробов и по 9 мл среды для анаэробов.

Из каждого антибиотика готовят два раствора – основной, а из него уже рабо-

чий. Используют агаровые 16-18 часовые культуры, которые смывают физиологи-

ческим раствороми по стандарту мутности готовят одномиллиардную взвесь в 1

78

мл. В каждую пробирку с рабочими разведениями антибиотика высевают по 0,2 мл одномиллиардной взвеси микробов. Учет результатов проводят визуально, через 16-18 часов инкубации при 37 °С. Отмечают пробирку, в которой отсутствует рост. Показатель концентрации антибиотика в ней складывают с количеством антибиотика в последующей пробирке, ГД отмечен рост культуры, и выводят среднее арифметическое, которое является показателем бактериостатической концентрации, характеризует чувствительность бактерии к антибиотику и называется ми-

нимальной ингибирующей концентрацией (МИК).

Если рост отмечен во всех пробирках ряда, то это указывает на устойчивость испытуемого организма к максимально взятой дозе антибиотика. Отсутствие роста во всех пробирках свидетельствует о том, что чувствительность микроба выше использованной в опыте минимальной концентрации.

Контрольные вопросы:

1.Как определить чувствительность микробов к антибактериальным препаратам.

2.Дать понятие асептики и антисептики.

3.На какие группы делятся антисептики.

4.Чем обусловлено взаимодействие фага с бактериальной клеткой.

5.На какие группы разделяют фаги по степени их специфичности.

Тема 1.10. Коллоквиум №2. «Культуральные и биохимические свойства

микробов»

Цель занятия: проверить остаточные знания студентов по пройденному мате-

риалу

Содержание:

1. Вопросы к коллоквиуму №2 «Культуральные и биохимические свойства

микробов»:

питательные среды. Требования, предъявляемые к ним;

классификация питательных сред;

техника посева микроорганизмов на жидкие питательные среды;

79

техника посева микроорганизмов на плотные питательные среды;

техника посева микроорганизмов на скошенный агар;

техника пересева микроорганизмов с оной питательной среды на дру-

гую;

учет роста микроорганизмов на жидких средах;

учет роста микроорганизмов на плотных средах;

методы выделения чистых культур;

изучение сахаролитических свойств микроорганизмов;

изучение протеолитических свойств микроорганизмов;

изучение гемолитических свойств микроорганизмов;

изучение окислительно-восстановительных ферментов микробов.

РАЗДЕЛ 2. ИНФЕКЦИЯ И ИММУНИТЕТ

Тема 2.1. Реакция агглютинации

Цель занятия: ознакомить студентов с сущностью серологических реакций и их применением; изучить реакцию агглютинации (РА) и варианты ее постановки.

Содержание:

1.Разновидности серологических реакций.

2.Постановка РА.

3.Модификации РА.

Антигены – генетически чужеродные вещества (белки), которые при попада-

нии в организм вызывают ответную реакцию – продуцирование организмом анти-

тел. Антигены бывают корпускулярные (молекулы), клеточные (бактерии, эритро-

циты) и растворимые (молкулярно-дисперсионные). Антигены имеют рецепторы для связывания со специфическими антителами, как в организме (invitro), так и в пробирке (invivo). Антигенной активностью обладают не только полноценные ан-

тигены (белки), но и гаптены (полисахариды, липидо-полисахаридный комплекс и др.).

Антитела – высокомолекулярные белки глобулиновой фракции сыворотки

крови (иммуноглобулины).

80