МУ Микробиология Лабораторные

Посев – это внесение микробов из исследуемого материала в стерильную пи-

тательную среду.

Пересев – перенос культуры микроба с одной питательной среды на другую – новую питательную среду.

Жидкий материал для посева берут бактериологической петлей или пасте-

ровской пипеткой. При посеве плотного материала чаще пользуются бактериоло-

гической петлей.

Все манипуляции, связанные с посевом и пересевом микробов, производят над пламенем горелки. Бактериологическую петлю прокаливают над пламенем непосредственно перед взятием материала, а затем ее охлаждают. После оконча-

ния посева петлю прожигают повторно для уничтожения находящихся на ней микробов.

Техника посева на поверхность

плотной питательной среды в чашках Петри

Посев бактериологической петлей – левой рукой приоткры-

вают чашку Петри, бактериологи-

ческой петлей посевной материал наносят на поверхность среды у

края чашки, избыток снимают,

проколов петлей агар, а оставший-

ся материал распределяют параллельными штрихами по стерильной поверхности среды. Петлю после посева фламбируют в пламени горелки (рисунок 48).

Посев шпателем – материал наносят на поверхность среды бактериологиче-

ской петлей или пастеровской пипеткой, а затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают его по всей поверхности агара. При этом левой рукой придерживают

новременно вращают чашку. После посева металлический шпатель фламбируют,

а стеклянный помещают в дезинфицирующий раствор (рисунок 49).

Посев тампоном – тампон с исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды. После по-

сева тампон помещают в дезинфицирующий раствор.

Посев отпечатком – в лабораторной практике допускается проводить посев кусочком пробы (лимфатический узел, кусочки паренхиматозных органов и др.)

путем нанесения отпечатков разными сторонами образца на поверхность пита-

тельной среды. Предварительно каждую пробу погружают на 2-3 минуты в спирт,

затем обжигают поверхность. После этого стерильными ножницами из глубины различных участков пробы вырезают кусочки размером не менее 2×1,5×2,5 см,

которыми и производят посев.

Метод посева «газоном» - 1 мл исследуемого материала (жидкая бульонная культура или взвесь микробов на физиологическом растворе) наносят пипеткой на поверхность среды. Избыток материала отсасывают пастеровской пипеткой и вместе с ней помещают в дезинфицирующий раствор.

Техника посева на скошенный агар

Пробирку берут в левую руку пробку из пробирки вынимают мизинцем правой руки,

прижав ее к ладони. При этом нельзя касаться

пальцами той части

Рисунок 50 - Техника посева на скошенный агар.

пробки, которая входит в пробирку. Петлю с исследуемым материалом опускают на поверхность пита-

тельной среды у дна пробирки и скользящими движениями делаю посев штрихом снизу вверх. После пересева горлышко пробирки обжигают в пламени и пробирку закрывают пробкой (рисунок 50).

62

Техника посева на жидкую

среду

Техника пересевов культур микробов

Культуру микроорганизма, выращенную на питательной среде, с целью изу-

чения культурально-биохимических свойств пересевают на другие среды. При этом в левую руку берут две пробирки: с культурой микроба, из которой произво-

дится пересев и со стерильной питательной средой. Пересев делают бактериаль-

ной петлей, которую держат в правой руке. Мизинцем и безымянным пальцем правой руки, извлекают одновременно две пробки из пробирок. Горлышки проби-

рок обжигают в пламени горелки. Обожженную петлю охлаждают прикосновени-

ем к внутренней стенки пробирки и погружают в культуру микроба, материал на петле переносят в стерильную среду. Затем обжигают горлышки пробирок, одно-

временно закрывают их пробками и ставят в штатив (рисунок 52).

Все посевы подписывают и помещают в термостат при температуре 37° С на сутки, за исключением посевов в МПЖ, который выдерживают при комнатной температуре или в термостате при 22°С в течение трех и более суток.

63

Рисунок 52 - Техника пересевов культур микробов с оной питатель-

ной среды на другую.

В жидкой средерост микроорганизмов проявляется либо равномерным по-

мутнением за счет увеличения числа бактериальных клеток, в основном подвиж-

ных или продуктов обмена бактерий; либо образующимся осадком (в этом случае

64

среда остается прозрачной). Осадок может быть рыхлый, легко разбивающийся при встряхивании пробирки, или слизистый, поднимающийся в виде «косички», «смерчика», а также в виде сплошной массы на дне пробирки или мелких крупи-

нок, располагающихся на стекле пробирки. Есть виды микроорганизмов, которые в силу особой потребности в кислороде воздуха растут на поверхности жидкой среды, образуя пленку и не вызывая помутнения бульона. Пленка может быть су-

хой и слизистой, гладкой и складчатой. В ряде случаев бактериальные культуры дают одновременно помутнение среды, обильный осадок и пристеночное кольцо на поверхности.

На плотной средекультуральные свойства определяют по характеру разви-

вающихся колоний. При внесении на поверхность среды большого количества бактериальных клеток наблюдают сплошной рост микробной массы. При высеве небольшого количества клеток на среду с большой поверхностью из каждой бак-

териальной клетки в результате ее деления (размножения) формируется колония.

Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросших из одной клетки (клон клеток). В зависимости от того, где растет микроорганизм

(на поверхности плотной питательной среды, в толще ее), различают поверхност-

ные, глубинные и донные колонии.

Колонии в диаметре могут быть мелкие (1-2 мм), крупные (более 4 мм) или совсем маленькие в виде мельчайших росинок. Различают колонии сухие, влаж-

ные (сочные) или слизистые; гладкие, глянцевые, шероховатые с неровной по-

верхностью, с ровными или неровными краями, выпуклые, плоские и с углубле-

нием посередине, прозрачные и матовые, бесцветные или пигментированные.

При описании колоний учитывают следующие признаки (рисунок 53):

-форму - округлая, амебовидная, неправильная и т.д.;

-размер - очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупные (более 5 мм в диаметре);

-поверхность – гладкая (S-форма) – микробные клетки располагаются, со-

прикасаясь своими боковыми поверхностями, шероховатая (R-форма) - микроб-

ные клетки располагаются цепочками, которые, накладываясь друг на друга, обу-

65

славливают шероховатую поверхность и неровный край колоний, складчатая,

морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;

-профиль - плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т.д.;

-прозрачность - тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, мучнистая;

-цвет (пигмент) - бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золоти-

стая, красная, черная), особо отмечают выделение пигмента в среду с ее окраши-

ванием;

- край - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т.д.;

Рисунок 53 - Разнообразные формы колоний микроорганизмов.

- структура - однородная, мелко или крупнозернистая, струйчатая; край и структуру колонии определяют с помощью лупы или на малом увеличении микро-

скопа, поместив чашку Петри с посевом на столик микроскопа крышкой вниз;

- консистенция - определяют прикасаясь к поверхности петлей, колония мо-

жет быть плотной, мягкой, врастающей в агар, слизистой (тянется за петлей),

хрупкой (легко ломается при соприкосновении с петлей).

66

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР

Чистая культура – это микроорганизмы одного вида, выросшие на пита-

тельной среде. Выделение чистой культуры является важным этапом бактериоло-

гического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологиче-

ских, культуральных, биохимических и антигенных свойств, по их совокупности устанавливается видовая принадлежность микроорганизма.

Микробная колония – это потомство или популяция одной микробной клетки при росте на плотных питательных средах.

1. Методы механического разделения микробов Метод Дригальского. Берут 3-4 чашки Петри со стерильным агаром, на по-

верхность первой наносят каплю смеси бактерий, которую стерильным шпателем растирают по поверхности агара, закрывают крышкой. Этим же шпателем расти-

рают по поверхности второй чашки, затем третьей и четвертой. Чашки помещают в термостат, перевернув вверх, чтобы конденсат не смыл колонии. Колонии изу-

чают по внешнему виду, готовят бактериологический препарат, окрашивают и микроскопируют (рисунок 54).

Рисунок 54 - Метод Дригальского.

67

Метод Пастера основан на последовательном разведении в 10 пробирках с жидкой средой капли смеси бактерий, с расчетом получить в последней пробирке чистую культуру. Кох, применил метод Пастера на плотных расплавленных сре-

дах и содержимое пробирки выливал в отдельную чашку Петри. Выдерживают в термостате. Пересевают отдельную колонию в среду с пробирками и получают чистую культуру.

2. Методы использования биологических особенностей микроорганизмов

Использование химических веществ, антибиотиков, добавленных к пита-

тельным средам для подавления роста некоторых микробов.

При выделении спорообразующих микроорганизмов исследуемый материал прогревают при 80 С – 20 мин, при этом вегетативные формы погибают, а споры прорастают. Затем выделяют культуру по Дригальскому.

Химический метод основан на устойчивости микобактерий к действию рас-

творов щелочей и кислот 6-18 % раствор серной кислоты в течение 30 мин, затем отмывают стерильным физраствором путем центрифугирования. Осадок высева-

ют на специальную среду, содержащую бактериостатическую краску, которая за-

держивает рост посторонней микрофлоры и не препятствует росту микобактерий.

Метод биологической пробы – вводят лабораторному животному исследуе-

мый материал, через несколько дней оно погибает и бактериологической петлей с внутренних органов делают посев на питательные среды. Проводят при очень за-

грязненном посторонней микрофлорой патматериале.

Для выделения подвижных культур каплю исследуемого материала поме-

щают на дно пробирки со скошенным агаром в конденсационную жидкость. При наличии в материале подвижных бактерий через 8-12 часов на поверхности агара отмечается рост бактерий. Пересев делают с самой верхней части агара.

Для выделения анаэробов посевы осуществляют в пробирках и чашках Петри,

помещенных в эксикатор или анаэростат.

Контрольные вопросы:

1. Как делают посев, пересев, отвивку микробов на различные питательные

среды

68

2.Что такое чистая культура

3.Как можно выделить чистую культуру

4.По каким характеристикам изучают колонии микробов

5.Что такое микробная колония, как ее можно получить

6.Как можно выделить чистую культуру анаэробов

Тема 1.8. Изучение культуральных и биохимических (ферментативных)

свойств микроорганизмов.

Цель занятия: изучить методы определения сахаролитических, протеолити-

ческих, редуцирующих и гемолитических свойств; изучить методы определения окислительно-восстановительных ферментов микроорганизмов.

Содержание:

1.Методы определения протеолитических ферментов.

2.Методы определения сахаролитических свойств микробов.

3.Определение окислительно-восстановительных ферментов.

4.Определение редуцирующих свойств.

5.Определение гемолитических свойств.

Врезультате питания, дыхания, размножения каждый

вид микробов продуцирует постоянный для него набор ферментов, одни из которых расщепляют белки, другие уг-

леводы, третьи вызывают окисление и восстановление раз-

личных субстратов. Для каждого вида микроорганизмов характерен свой набор ферментов, поэтому их наряду с другими признаками можно использовать для идентифика-

ции.

Определение протеолитических ферментов

Некоторые микроорганизмы при осте на питательных

ем других ферментов эти продукты распадаются на отдельные аминокислоты. Не-

которые патогенные виды микробов с выраженной протеолитической активно-

стью расщепляют белки до конечных продуктов – индола, сероводорода, аммиака.

Индол и сероводород имеют наибольшее значение при определении вида микро-

организма. Для изучения протеолитических свойств микробов исследуемую куль-

туру высевают на питательные среды, содержащие тот или иной белок.

Определение сероводорода. Под пробку пробирки с МПБ и исследуемой культурой помещают полоску индикаторной бумаги, пропитанной ацетатом свин-

ца (уксуснокислым свинцом). Индикаторная бумага не должна касаться питатель-

ной среды. В положительных случаях образующийся сероводород вступает в со-

единение с бесцветным ацетатом свинца. Образуется сульфид свинца, который придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашива-

ние(рисунок 55).

Определение сероводорода можно также проводить,

учитывая рост культуры на комбинированных плотных средах Клиглера, Олькеницкого. Если выделяется серово-

дород, то в этих средах он взаимодействует сернокислым железом (соль Мора). Образуется сульфид железа черного цвета, столбик среды чернеет.

Определение индола. Индол можно обнаружить раз-

личными методами. Наиболее доступным и удобным счи-

тают метод с использованием индикаторных бумажек.

При использовании бумажек с щавелевой кислотой их по-

мещают под пробку пробирки с МПБ. При наличии индола нижняя часть бумажки

окрашивается в бледно-розовый цвет (рисунок 56). Рисунок 56 - Опре-

деление индола.

70