МУ Микробиология Лабораторные

Контрольные вопросы:

1.Чем отличается стерилизация от дезинфекции.

2.Как осуществляют стерилизацию текучим паром.

3.Что такое тиндализация. Для каких сред ее применяют.

4.Объяснить метод пастеризации.

5.В чем сущность дробного метода стерилизации.

Тема 1.6. Приготовление питательных сред.

Цель занятия: изучить требования к питательным средам классификацию пи-

тательных сред, ознакомиться с составом, назначением простых, специальных,

элективных и дифференциально-диагностических сред. Ознакомиться с приготов-

лением питательных сред.

Содержание:

1.Требования, предъявляемые к питательным средам.

2.Состав питательных сред.

3.Классификация питательных сред.

Для культивирования микроорганизмов в лабораторных условиях применяют различные искусственные питательные среды. На них микроорганизмы выделяют,

изучают, накапливают и хранят.

Питательные среды по своей сущности являются искусственной средой оби-

тания микробов и поэтому должны соответствовать следующим требованиям:

- содержать основные питательные вещества, из которых строится мик-

робная клетка: макроэлементы (азот, углерод, водород, кислород, фосфор, железо,

калий, кальций, сера, магний), микроэлементы (кобальт, йод, марганец, молибден,

цинк, медь и др.), витамины. Все элементы должны находится в легкоусвояемой для конкретного микроорганизма форме. В питательные среды добавляют амино-

кислоты, органические кислоты, витамины, сахара, многоатомные спирты, белки,

соли различных кислот и воду;

- иметь достаточную влажность (не менее 20 % воды), т.к. поступление веществ в микробную клетку осуществляется при помощи диффузии и осмоса;

51

-быть изотоничными, т.е. иметь концентрацию солей соответствующую концентрации солей в микробной клетке (для большинства микроорганизмов 0,5 %, для галлофилов – 3 %);

-быть нетоксичными для исследуемых микробов;

-обладать оптимальной для выращиваемого микроорганизма концентра-

цией водородных ионов (рН). Питательные вещества могут усваиваться микроба-

ми только при определенной реакции питательной среды, т.к. от этого показателя зависит проницаемость оболочки микробной клетки. Для большинства микроор-

ганизмов оптимум роста наблюдается при рН 7,2-7,4;

-быть по возможности прозрачными, т.к. это облегчает изучение в них роста микробов;

-быть стерильными, чтобы была возможность размножать в них культуру только одного вида микроба.

Классификация питательных сред

Потребность в питательных веществах у различных микробов неодинакова,

поэтому нет возможности создать для них универсальную питательную среду. На основании разных показателей питательные среды классифицируют следующим образом.

1.По консистенции: жидкие, плотные, полужидкие;

2.По происхождению - животного, растительного происхождения и синте-

тические среды постоянного состава;

3. По назначению:

-обычные (простые) - для выращивания большинства микроорганизмов;

-специальные - для культивирования микробов, не растущих или плохо рас-

тущих на обычных питательных средах;

- дифференциально-диагностические - употребляемые для определения родо-

вых или видовых особенностей исследуемых бактериальных культур (гемолити-

ческих, сахаролитических, протеолитических, редуцирующих и других свойств);

52

- элективные - для выделения микробов одного рода или вида из материала,

содержащего смесь разных видов микроорганизмов, на которых одни виды хоро-

шо растут, а другие не растут;

- среды обогащения (накопительные).

Основой многих питательных сред животного происхождения является мясная вода. Ее готовят из свежего нежирного говяжьего мяса, освобожденного от костей, фасций, сухожилий. Измельченное мясо (мелкие кусочки или фарш) за-

ливают дистиллированной водой в соотношении 1:2 (на 1 кг мяса 2 л воды). Экс-

трагируют 12-24 ч, кипятят 1,5-2 ч, фильтруют, добавляют дистиллированной воды до первоначального объема, разливают в бутыли, колбы, закрывают ватно-

марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве.

Простые питательные среды

Мясо-пептонный бульон (МПБ) - жидкая питательная среда (рисунок 38). Для его приготовления к 1 л мясной во-

ды добавляют 1 % пептона, 0,5 % химически чистой пова-

ренной соли и кипятят. Мясная вода слабокислой реакции,

поэтому МПБ подщелачивают – добавляют небольшое ко-

личество 10-15 % раствора КОН или NaOH, кипятят 2-3

53

клавируют. После стерилизации горячие пробирки с агаром раскладывают наклонно под углом 5-6°. При застывании образуется скошенная плотная поверх-

ность.

Мясо-пептонный полужидкий агар готовят так же, как и МПА но агар-агара

добавляют меньше – 0,2 %.

Мясо-пептонный желатин (МПЖ). К МПБ добавляют 10-20 % желатина

(продукт, получаемый из клейдающих тканей животных), расплавляют и в горя-

чем виде устанавливают нужную реакцию среды, пропускают через ватно-

марлевый фильтр, разливают в пробирки, стерилизуют текучим паром дробно. На рисунке 40 представлены различные формы разжижения желатина.

Рисунок 40 - Формы расщепления желатина.

Молоко – натуральная естественная питательная среда. Цельное молоко обезжиривают центрифугированием, разводят водой 1:1, устанавливают рН 7,0-7,3

с помощью питьевой силы. Молоко стерилизуют дробно текучим паром 3 дня в автоклаве при 110 °С 20 мин. При изучении редуцирующих свойств микробов пе-

ред стерилизацией добавляют 2 % раствор метиленового синего из расчета 2 мл краски на 100 мл среды.

Специальные питательные среды

Анаэробы – большая группа микроорганизмов, которые растут и размножа-

ются при отсутствии кислорода воздуха. Анаэробный тип дыхания менее продук-

тивный, чем аэробный, поэтому питательные среды для анаэробов должны быть богаче питательными субстратами и витаминами. Для удаления из сред кислорода

54

в них помещают кусочки печени, головного мозга, почек. Тканевые клетки обла-

дают редуцирующими свойствами, т.е. активно поглощают и адсорбируют на себе кислород, в результате чего в среде создаются анаэробные условия. Среды в про-

бирки разливают высоким столбиком в объеме 10-12 мл. Кислород воздуха диф-

фундирует обычно на расстоянии 1-2 см от поверхности, а в глубине создаются анаэробные условия.

чени. В пробирки поверх среды наливают 1-2 мл вазелинового масла и стерилизу-

ют в автоклаве при 0,5 атм. 30 мин.

Сахарно-кровяной агар Цейсслера (специальная обогащенная среда для анаэробов). Готовят 3 % МПА и добавляют 2 % глюкозы и 10-20 дефибриниро-

ванной крови, подсушивают 4-6 часов в термостате и ис-

пользуют.

Методы создания анаэробных условий

1. Физические методы:

- основной и наиболее часто применяемый метод - вы-

ращивание культур анаэробов в специальных приборах –

анаэростатах (рисунок 42), из которых откачивается воз-

дух с помощью механического насоса. В анаэростатах со-

здается отрицательное давление, уровень которого контро-

лирует манометр. Чашки с посевами на поверхности среды помещают в анаэростат вверх крышкой, герметично закрывают крышку Рисунок 42 - Анаэростат.

55

анаэростата и откачивают воздух. Анаэростат помещают в термостат. Учет роста проводят через 1-2 дня.

- выращивание микроорганизмов в глубине питательной среды, разлитой

«высоким столбиком». При таком способе культивирования среды часто подвер-

гают дополнительной обработке: прогревают питательные среды на водяной бане для удаления растворенного кислорода; наслаивают на поверхность питательной среды вазелиновое масло, расплавленный парафин и другие компоненты, не про-

пускающие воздух.

2. Химические методы, основанные на поглоще-

нии свободного кислорода воздуха в результате хими-

ческих реакций. Реактивы (гипосульфит натрия и гид-

роксид калия) смешивают, слегка увлажняют водой и в открытой чашке ставят на дно специального стеклянно-

го сосуда с плотно закрывающейся крышкой – эксика-

тора(рисунок 43) непосредственно перед размещением

в ней чашек с посевами.

Рисунок 42 - Эксикотор.

3. Биологические методы – совместное выращи-

вание культур аэробов и анаэробов. Применяют крайне редко. В чашку Петри наливают сахарно-кровяной агар. После застывания агара посредине чашки в пи-

тательной среде вырезают канавку шириной 1-1,5 см, которая делит питательную среду на две половинки. Одну из них засевают культурой аэробов (чудесная или кишечная палочка), другую – анаэробов. Для предупреждения поступления кисло-

рода извне крышку заклеивают лейкопластырем. Чашки с посевами устанавлива-

ют в термостате вверх дном. Быстрорастущие аэробы, поглощая кислород, созда-

ют условия для роста анаэробов.

Сахарный (глюкозный) бульон (или агар) изготавливают как обычные среды,

но к ним добавляют 1-2 % глюкозы и стерилизуют текучим паром или автоклави-

руют при 0,5 атм.

Сывороточный бульон и сывороточный мясо-пептонный агар готовят пу-

тем асептического добавления к МПБ или расплавленному и охлажденному до 45-

56

50° МПА 5-10 % стерильной сыворотки крови лошади (барана, кролика), затем сывороточный бульон разливают в стерильные пробирки (колбы).

Среда Петраньяни (среда для выращивания микобактерий туберкуле-

за)содержит цельное молоко, пептон, крахмал, поваренную соль, картофель, кури-

ные яйца, желток, глицерин, малахитовая зелень.

Дифференциально-диагностические среды Кровяной МПА применяют для выявления гемолитических свойств бактерий.

Дефибринированную кровь (5-10 %) стерильно добавляют к расплавленному и остуженному МПА, легким вращением колбочки равномерно смешивают и разли-

вают в стерильные чашки Петри.

Рисунок 43 - Среды Гисса: а - жидкая среда с углеводами и индикатором Андреде; б - полужидкая среда с индикатором ВР: 1 - микроорганизмы не ферментируют углевод; 2 - микроорганизмы ферментируют углевод с образованием кислоты; 3 - микроорганизмы ферментируют углевод с образованием кислоты и газа.

Среды Гисса. В пептонную воду (состоящую из дистиллированной воды, 0,5

% NaCl и 1 % пептона) добавляют 0,5 % углевода (сахар или многоатомный

57

спирт) и 0,5 % индикатора Андрэдэ (0,5 г кислого фуксина, 16 мл 4 % NaOH, 100

мл дистиллированной воды). Среды с углеводами разливают в пробирки с «газо-

вичками» (поплавками), опущенными в пробирки вверх дном. Стерилизуют среды с углеводами текучим паром дробно. Среды Гисса могут быть жидкие и полужид-

кие (без газовок), содержащие 0,25 % агара. При ферментации того или иного уг-

левода микробом, растущим в данной среде, образуется кислота, под действием которой восстанавливается цвет краски индикатора. Среда приобретает красный цвет. Образовавшиеся при ферментации углевода газообразные продукты скапли-

ваются в поплавках (рисунок 43).

Среда Эндо. В расплавленный МПА вносят 0,5-1 %

лактозы и 0,5 % насыщенного спиртового раствора ос-

новного фуксина, обесцвеченного добавлением по кап-

лям 10 сернокислого натрия. Среду кипятят и разлива-

ют в чашки Петри. Бактерии, сбраживающие лактозу,

на этой среде растут в виде красных колоний, а лакто-

других биологических особенностей. Их составляют из химически чистых раство-

римых в воде веществ, в строго определенных количествах. Например, среда Со-

тона.

Для культивирования дрожжей и плесневых грибов используют среду Сабуро

– на 100 мл воды добавляют глюкозы - 4 г, пептона - 1 г, агара - 1,8 г. Стерилизу-

ют автоклавированием (рисунок 48).

Контрольные вопросы:

1.Как готовят МПБ, МПА, как их стерилизуют.

2.Каково назначение специальных питательных сред.

3.Как учитывают расщепление микробом сахаров в цветных средах.

4.Каков состав средЭндо, Левина, Плоскирева.

5.На чем основан принцип использования среды Китта-Тароцци и висмут-

сульфит агара.

6.Состав среды Сабуро.

7.Какие существуют среды накопления.

Тема 1.7. Посев и культивирование микроорганизмов. Методы выделения

чистых культур микробов.

Цель занятия: освоить технику посева материала на питательные среды, тех-

нику пересева, отвивки колоний; освоить методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных микроорганизмов; освоить методы использования биоло-

гических особенностей микроорганизмов: физический (термический) метод для выделения споровых микроорганизмов; химический метод на устойчивость неко-

торых микроорганизмов к действию растворов кислот и щелочей; биологический метод заражения чувствительных лабораторных животных.

Содержание:

1.Посев и культивирование микроорганизмов.

2.Методы выделения чистых культур.

Культуральные свойства – рост микроорганизмов на питательных средах.

60