МУ Микробиология Лабораторные

клетка теряет значительное количество свободной воды, протоплазма уплотняется и покрывается плотной оболочкой, пропитанной смолистыми и липоидными ве-

ществами.

Строение зрелой споры сложное и однотипное у разных видов бактерий.

Центральная ее часть представлена сердцевиной, или спороплазмой, содержащей нуклеоид, рибосомы и нечетко выраженные мембраны структуры. Спороплазма окружена цитоплазматической мембраной, к которой прилегает зачаточный пеп-

тидогликановый слой, затем специфическим для спор массивным слоем кортек-

са,или коры. На поверхности кортекса имеется внешняя мембрана. Снаружи спо-

ра окружена многослойной оболочкой. У многих бактерий по окружности наруж-

ного слоя споровой оболочки располагается экзоспорум.

Бактериальные споры обладают высокой устойчивостью к факторам внеш-

ней среды благодаря следующим свойствам:

1.у зрелых спор обмен веществ находится на крайне низком уровне, так как отсутствует свободная вода (вода находится в связанном состоянии);

2.высокая концентрация магния и кальция увеличивает устойчивость спор к нагреванию;

3.малая ферментативная активностью спор;

4.наличие многослойных оболочек, из которых наружная экзина –защищает спору от факторов внешней среды из-за плохой проницаемости, внутренняя – ин-

тина – способствует прорастанию споры (переход в вегетативную форму) при по-

падании в благоприятные условия.

Если диаметр споры меньше толщины микробной клетки, такие бактерии называют - бациллы (Bacillusanthracis). Если диаметр споры больше толщины микробной клетки – клостридии(Clostridiumtetani). Данные спорообразующие бак-

терии представлены на рисунке 22.

31

Рисунок 22 - Спорообразующие бактерии.

Споры образуются в средах с нейтральной или слабощелочной реакцией при дефиците белковых веществ. Установлено, что этот процесс происходит намного быстрее в присутствии кислорода воздуха. Споры не образуются в средах, богатых белковыми веществами, например, в крови и сыворотке крови, живом организме и невскрытом трупе. При нарушении целостности трупа возможно спорообразова-

ние. Образование спор зависит от температуры среды.

Например, процесс спорообразования возбудителя сибирской язвы при тем-

пературе 30 – 37о С заканчивается через 1-2 часа, при 24оС – через 16 часов, при 18

оС – затягивается до 70 часов. Ниже 15оС и выше 42оС у возбудителя сибирской язвы процесс спорообразования не происходит. А после попадания в благоприят-

ные условия споры начинают прорастать уже через 5-10 минут.

Прорастание спящей споры в активную вегетативную клетку — не менее сложный процесс, чем спорообразование. Оно проходит в три стадии:

активация;

созревание;

прорастание.

При прорастании споры (от 1 до нескольких часов, в среднем спора образует-

ся за 4-8 часов) оболочка постепенно набухает, мутнеет, увеличивается в размерах

32

и разрывается. Как правило, она разрывается в одном месте, в центре или по по-

люсам, из места разрыва выходит бактерийный отросток, который затем развива-

ется в бактериальную клетку.

В ветеринарной микробиологии выявление спор используют в качестве диф-

ференциального морфологического признака.

Для окрашивания спор используют специальные, сложные методы окраски,

где используются контрастные краски.

Рассмотрим два метода окраски по Пешкову иВиртцу.

Метод Пешкова:

1. Мазок фиксируют, красят метиленовой синькой с подогреванием до кипе-

ния, смывают.

2. Докрашивают 1 % водным раствором фуксина Пфейффера в течение 10 се-

кунд, смывают, высушивают.

В результате споры окрашиваются в синий цвет, а бактериальные клетки – в

красный.

Метод Виртца:

1. На фиксированный мазок помещают фильтровальную бумагу, смачивают малахитовой зеленью при подогревании над пламенем горелки до появления па-

ров в течение 5 минут.

2. Фильтровальную бумагу убирают, мазок остужают, промывают водой, до-

крашивают водным раствором сафранина 2 минуты, промывают водой, высуши-

вают на воздухе и изучают под иммерсионной си-

стемой.

В результате споры окрашиваются в зеленый цвет, а вегетативные клетки - в красный.

Капсула – это непостоянный структурный элемент бактериальной клетки, она не является обязательной структурой бактериальной клетки:

23). В природе известны бескапсульные штаммы бактерий.

Представляет из себя слизистый слой над клеточной стенкой бактерии.

Капсула может окружать как одну так и несколько бактериальных клеток.

Существуют бактерии, синтезирующие слизь на поверхности клеточной стенки в виде бесструктурного слоя полисахаридной природы. Слизистое вещество, окру-

жающее клетку, по толщине часто превосходят толщину последней. Например, у

сапрофитной бактерииLeiconostoc наблюдается образование одной капсулы для многих особей. Такие скопления бактерий, заключённые в общую капсулу назы-

вают зооглеями.

Капсулы обеспечивают выживание бактерий, защищая их от механических повреждений, высыхания, токсических веществ, заражения фагами, а у патоген-

ных форм от действия фагоцитов. У некоторых видов бактерий, в том числе и па-

тогенных, капсула способствует прикреплению клеток к субстрату.

В зависимости от толщины слоя и прочности соединения с бактериальной клеткой различают видимую макрокапсулу (толщина 0,2 мкм) и микрокапсулу

(толщина менее 0,2 мкм), обнаруживаемую лишь при электронной микроскопии или химическими и иммунологическими методами.

Макрокапсулу (истинную капсулу) образуют B.anthracis,Cl.perfringens, мик-

рокапсулу– некоторые штаммыEscherichiacoli.

Вещество капсулы – муциноподобное, состоит из высокогидрофильных фиб-

рилл, которые по химической структуре представляют из себя:

 высокомолекулярные полисахариды, являющиеся производными наруж-

ного слоя оболочки (гомо-или гетерополисахаридыу энтеробактерий);

полипептиды (B.anthracis);

гликопептиды (корд-фактор у M.tuberculosis);

рыхлый слизистый слой.

Капсулы образуются в организме хозяина и на питательных средах, содержа-

щих белки. Капсулообразованию кроме нативного белка способствует щелочная среда и наличие углекислого газа. При попадании в иммунный организм капсулы,

по-видимому, образуются очень медленно и довольно редко.

34

Синтез капсулы – сложный видоспецифический процесс у различных прока-

риот. Биополимеры капсулы синтезируются на наружной поверхности цитоплаз-

матической мембраны и выделяются на поверхность клеточной стенки в опреде-

лённых специфических её участках.

Капсула – полифункциональный органоид, выполняющий важную биологи-

ческую роль. Служит местом локализации капсульных антигенов, определяющих вирулентность, антигенную специфичность и иммуногенность бактерий. У пато-

генных бактерий при утрате капсулы резко снижается вирулентность, например у бескапсульных штаммов B.anthracis.

В ветеринарной микробиологии выявление капсулы используют в качестве дифференциального морфологического признака.

Микрокапсулу и слизистый слой определяют серологическими реакциями:

реакцией агглютинации (РА), антигенные компоненты капсулы идентифицируют при помощи реакции иммунной флюоресценции (РИФ) и реакции диффузной преципитации (РДП).

Капсулы легко окрашиваются и также легко обесцвечиваются, поэтому для ее выявления выделяют методы окраски, основанные на явлении метахромазии (это свойство клеток и тканей окрашиваться в цветовой тон, отличающийся от цвета самого красителя, а также свойство изменённых клеток и тканей окрашиваться в иной цвет по сравнению с нормальными клетками и тканями). Для окрашивания бактерий на наличие капсулы необходимо исследовать только свежий материал,

так как капсулы быстро лизируются.

Для обнаружения капсул применяют специальные методы – Романовского-

Гимзы, Гинзы-Бурри, Ольта, Михина и др., рассмотрим два из них: по Ольту и по Михину.

Метод Михина:

1. На фиксированный мазок наносят метиленовую синь на 5-7 минут и подо-

гревают до появления паров.

2. Краску смывают водой, высушивают мазок на воздухе и смотрят в свето-

вой микроскоп под иммерсионной системой.

35

В результате бактериальная клетка окрашивается в синий, а сама капсула ста-

новится бледно розовый цвет.

Метод Ольта:

1. На фиксированный мазок наносят свежий 2 % раствор сафранина на 5 – 7

минут.

2. Препарат промывают водой, высушивают на воздухе и просматривают в световой микроскоп под иммерсионной системой.

Бактериальная клетка окрашивается в кирпично-красный, капсула в желто-

оранжевый цвет.

Жгутики имеются только у подвижных микроорганизмов. Они очень тонкие,

т.к. их величина за пределами разрешающей способности светового микроскопа и они плохо окрашивают, их редко красят. Обычно исследуют на подвижность в живом состоянии. На подвижность исследуют микроорганизмы с опущенным конденсором и затемненном полем зрения. Используют метод висячей и раздав-

ленной капли.

Рисунок 24 - Расположение жгутиков у бактерий.

Жгутики делят на монотрихи – один жгутик на одном конце клетки, ло-

фотрихи – несколько жгутиков на одном конце клетки, амфитрихи – жгутики на обоих полюсах клетки и перитрихи – большое количество жгутиков по всей по-

верхности клетки (рисунок 24).

Метод раздавленной капли. На центр предметного стекла наносят каплю ис-

следуемого материала и накрывают покровным стеклом так, чтобы не появились пузырьки воздуха. Проводят исследование подвижности микроорганизмов под

36

микроскопом. Недостатком данного метода является быстрое высыхание препара-

та, поэтому при длительном исследовании рекомендуется смазывать края покровного стекла вазелином (рисунок 25).

Метод висячей капли. Используют спе-

циальные толстые предметные стекла с лун-

кой в центре. Края лунки смазывают вазели-

ном и на центр покровного стекла помещают каплю исследуемого материала. Предметное стекло накладывают на покровное так, чтобы капля находилась в центре лунки. Затем его осторожно переворачивают, и капля свисает в центре герметически закрытой лунки (так капля защищена от высыхания). Недостатком метода являются оптические дефекты из-за толщины стекла и наличия лунки.

Контрольные вопросы:

1.Как окрашиваются споры методом Виртца.

2.Как делятся бактерии по расположению спор.

3.Как окрашиваются споры методом Пешкова.

4.Как окрашиваются капсулы методом Ольта.

5.Что такое капсулы бактерий.

6.Как окрашиваются капсулы методом Михина.

7.Морфология подвижных микробов.

8.Определение подвижности методами «раздавленной» и «висячей» капли.

Тема 1.4. Изучение морфологии грибов и актиномицетов.

Цель занятия: изучить морфологию грибов и актиномицетов, ознакомиться со строением грибов и их подразделением на низшие и высшие. Иметь понятие о способах размножения грибов, изучить видоизменения мицелия. Ознакомиться со

37

строением актиномицетов. Знать, что сближает актиномицеты с бактериями, а что с грибами.

Содержание:

1.Морфология грибов.

2.Морфология актиномицетов.

Грибы (Fungi) - бесхлорофильные низшие эукариотические организмы. Их используют в хлебопечении, пивоварении, приготовлении кондитерских изделий.

Они обогащают почву гумусом, разлагая остатки растений, улучшают питание растений. Грибы используют как продуценты антибиотиков. Также они коррози-

руют металл, разрушают пластик, картины, книги, приводят к порче продуктов питания и кормов, вызывают микозы и микотоксикозы животных, птиц и челове-

ка.

Вегетативное тело грибов - это грибница (мицелий), состоящий из ветвящих-

ся нитей (гифы). По строению мицелия грибы делят на низшие и высшие.

У низших грибов (фикомице-

ты) мицелий (несептированный)

представлен одной разветвленной гигантской клеткой с многочис-

ленными ядрами без перегородок

(септ).

У высших грибов в гифах ми-

целия есть перегородки (септы),

разделяющие их на отдельные од-

ноядерные или многоядерные клетки, т.е. мицелий высших гри-

бов септированный.

ся споры, которые называются конидиями, а гифы, несущие их, - конидиеносца-

ми. У других грибов споры образуются внутри особых клеток, развивающихся на

38

Рисунок 27Плодовые тела микроскопических грибов.

концах гиф. Эти клетки называются спорангиями, а гифы, несущие их, - споран-

гиеносцами. Созревшие конидии осыпаются, а спорангии лопаются, и из них вы-

сыпаются споры, которые в благоприятных условиях прорастают (рисунок 26).

При половом размножении сначала происходит слияние двух близлежащих клеток. Затем процесс размножения протекает у различных видов грибов по-

разному. У одних образуется клетка, называемая зиготой, которая затем прораста-

ет в новый мицелий; у других грибов образуется плодовое тело, внутри которого развиваются сумки - аски - со спорами. Попадая в благоприятные условия, споры созревают, сумка разрывается, и споры, прорастая, образуют новый мицелий.

Споры грибов очень устойчивы к внешним воздействиям, они могут в течение не-

скольких лет сохранять жизнеспособность (рисунок 27).

У некоторых грибов существуют следующие видоизменения мицелия:

-тяжи, состоящие из параллельно идущих, сплетенных, присоединяющихся анастомозами грибов, не отличающихся друг от друга;

-ризоиды - корешкообразные выросты на мицелии гриба необходимые для прикрепления к субстрату и потребления из него питательных веществ;

-ризоморфыс темноокрашенным плотным наружным слоем гифов, нередко

имеющие внутри гифы более крупного диаметра с частично или полностью рас-

39

творенными перегородками между клетками, которые выполняют роль проводя-

щих элементов, способствуют распространению гриба по субстрату, снабжению его питательными веществами;

-склероции- удлиненные, округлые уплотнения мицелия, могут сохранять свою жизнеспособность длительное время, а при прорастании дают мицелий;

-псевдопаренхима, или плектенхима, - это ложная ткань, из которой состоят плодовые тела, склероции. Эта ткань формируется путем более или менее плотно-

го сплетения гифов.

Клетка гриба имеет оболочку, протоплазму, ядро и ряд включений. В отличие от бактерий она содержит истинное ядро, а от низших грибов (архимицетов) ее отличает наличие клеточной стенки, в состав которой входит целлюлоза и (или)

хитин.

Молодые клетки яйцевидной формы, удлиненные в виде трубочки, зрелые -

цилиндрические, при старении клетки могут иметь грушевидную, булавовидную,

веретенообразную или амебовидную форму. Оболочка стенки гриба состоит из двух слоев - наружного (хитинового) и внутреннего, образованного из целлюлозы;

пространство между ними заполнено полисахаридами.

Непосредственно к целлюлозной части стенки прилегает двухконтурная ци-

топлазматическая мембрана, с которой находится в тесном контакте эндоплазма-

тический ретикулум, часто гранулярный, составляющий основную часть цито-

плазмы. В цитоплазме расположены одно или несколько ядер округлой, овальной или неправильной формы, окруженных собственной оболочкой с порами, и яд-

рышко, содержащее в составе хромосом ДНК. В клетках могут накапливаться раз-

личные продукты метаболизма грибов - антибиотики, ферменты, витамины, ток-

сины и др.

Классификация

При определении класса грибов учитывают строение грибницы и органов размножения. По принципу строения органов размножения все грибы делят:

низшие грибы:

I класс - архимицеты,

40