МУ Микробиология Лабораторные

Из насыщенных спиртовых растворов готовят спиртоводные растворы. Вод-

ные растворы готовят непосредственноперед применением,т.к. они разлагаются на свету. Для усиления действия красителя к нему добавляют протравляющее веще-

ство. Это либо добавление в растворы красок фенола или едкого калия, либо обра-

ботка препарата перед окрашиванием слабыми растворами соляной, серной или хромовой кислот, либо прогревание препарата с нанесенной на него краской над пламенем горелки в течение нескольких секунд.

Приготовление раствора фуксина Циля (карболовый фуксин). Кристаллы основного фук-

сина 5-10 г растворяют в 100 мл 96 ° этилового спирта. 10-20 мл готового насыщенного раствора соединяют со 100 мл дистиллированной воды для получения спирто-водного раствора. Добавляют 5 % фенола в качестве протравы.

Приготовление раствора фуксина Пфейффера. 10 мл фуксина Циля соединяют со 100 мл дистиллированной воды.

Приготовление генцианвиолета. 1 г сухого генцианвиолета растворяют в 10 мл спирта, добавляют дистиллированную воду. Берут листки фильтровальной бумаги 1х1 см и пропитывают ее получившимся раствором, высушивают на воздухе. При окраске его накладывают на мазок, наливают несколько капель воды и выдерживают 2-3 мин.

Приготовление раствора метиленовой синьки (синька Леффлера). 3 г краски настаивают

3-4 мес. в 100 мл 96 этилового спирта, затем 30 мл насыщенного раствора разбавляют в 100 мл дистиллированной воды, содержащей 1 мл 1 % раствора едкого калия (протрава), фильтруют.

Техника приготовлениябактериологических препаратов (мазков)

Мазки готовят на предметном стекле. В качестве материала применяют взвесь бактерий, бактериальную культуру, молоко, кровь, мазки отпечатки.

Из жидкой микробной культуры для приготовления мазка в левой руке дер-

жат пробирку, в правой бактериологическую петлю. Тщательно прожигают ее в пламени горелки. Пробирку открывают у пламени горелки. Петлей захватывают каплю материала, пробирку закрывают и ставят в штатив. Наносят на предметное стекло каплю и растирают до размера рубля. Препарат выдерживают на воздухе,

петлю прожигают. Препарат фиксируют – над пламенем горелки либо смесь Ни-

кифорова.

Методы фиксации мазков:

Физический способ. Для фиксации используют мазки, приготовленные из бу-

льонных или агаровых культур. С обратной стороны мазка карандашом по стеклу или маркером обводят его границы. Стекло с мазком, обращенным вверх, медлен-

21

но проводят 3-4 раза над верхней частью пламени горелки, нагревая стекло не выше 60 °С.

Химический способ используют для фиксации мазков из крови, мазков-

отпечатков, и в некоторых случаях, мазков и патологического материала, т.к. вы-

сокие температуры разрушают клеточные элементы. Для этих целей мазки погру-

жают в фиксирующие жидкости: метиловый спирт – 5 мин, ацетон – 5 мин, этило-

вый спирт – 10 мин, смесь Никифорова – 15-20 мин.

Целью фиксации является закрепление микроорганизмов на стекле, обезвре-

живание микробных клеток, коагуляция белков микробных клеток, после чего они легко воспринимают окраску.

Для приготовления мазков из культуры, выращенной на плотной питательной среде, на обезжиренное предметное стекло бактериологической петлей, предвари-

тельно прокаленной до красна (профламбированной) наносят небольшую каплю стерильного физиологического раствора. Затем петлю фламбируют повторно, вно-

ся ее в пламя горелки в вертикальном положении, после чего в пробирку (чашку Петри) с культурой вносят бактериологическую петлю, предварительно охладив ее о поверхность стекла. Петлю с культурой осторожно вынимают и вносят в при-

готовленную заранее на предметном стекле каплю физиологического раствора,

тщательно размешивают, равномерно распределяя по стеклу в виде небольшого круга, овала (2 см в диаметре). После окончания приготовления мазка петлю вновь прокаливают (рисунок 15).

22

Рисунок 15 - Этапы приготовления бактериологического препарата.

Простые методы окраски бактерий

При простых методах окраски применяют только один краситель, чаще всего фуксин Пфейффера, метиленовый синий. Раствор красителя наносят на препарат и

23

выдерживают 2-3 мин, затем краску смывают водой, препарат высушивают филь-

тровальной бумагой и рассматривают под иммерсией. Простая окраска позволяет обнаружить в материале бактерии, быстро определить их морфологию и иметь представление о разнообразии видов.

Сложные методы окраски

Сложные методы окраски основаны на физико-химических различиях состава микробных клеток, их применяют для дифференциации одних бактерий от др.

Сущность этих методов заключается в последовательном воздействии на мазок двух красящих растворов, из которых один является основным, а другой – кон-

трастным. Кроме красящих растворов, применяют различные обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты. В результате разные виды микробов или отдельные структуры внутри микробной клетки окрашиваются в контрастные и разные веще-

ства.

Окрашенные препараты имеют следующие преимущества:

- они неопасны, т.к. все манипуляции проводят с фиксированным и обезвре-

женным материалом;

-в них легко различимы отдельные детали, структуры микробной клетки, не выявляющиеся в неокрашенном препарате;

-могут храниться длительное время.

Недостатки:

- невозможность изучения физиологии микробов (подвижность, характер де-

ления и т.д.);

- деформация микробных клеток после фиксации физическим методом и воз-

действия красящих растворов.

Окраска по Граму

Предложен в 1884 году датским врачом Г. К. Грамом. Ганс Кристиан Йоахим-

Грам (дат. Hans Christian Joachim Gram; 13 сентября 1853 - 14 ноября 1938)-

датский бактериолог. Грам изучал ботанику в Университете Копенгагена и был ассистентом ботаники у зоолога Япетуса Стенструпа.

24

Он поступил в медицинскую школу в 1878 году и закончил её в 1883. Меж-

ду 1878 и 1885 годами Грам путешествовал по Европе. В Берлине, в 1884, он раз-

работал метод разделения двух основных классов бактерий. Метод окраски Грама продолжает оставаться стандартной процедурой в медицинской и ветеринарной микробиологии.

В 1891 году Грам начал читать лекции по фармакологии, и позже в том же году был назначен профессором в Университете Копенгагена. В 1900 он стал профессо-

ром медицины.

Работой, которая принесла ему мировую известность, стала разработка метода окраски бактерий. Метод впоследствии играл главную роль в классификации бак-

терий. Грам в своей первой публикации отметил: «И таким образом я публикую метод, несмотря на то, что знаю, что сейчас он имеет недостатки и несовершенен;

но я также надеюсь, что в руках других исследователей он превратится во что-то полезное».

При окраске по этому методу все бактерии подразделяются на грамположи-

тельные и грамотрицательные, что облегчает проведение дифференциальной диа-

гностики инфекционных заболеваний и выбор средств антимикробной терапии.

Окраска состоит из следующих этапов:

1. На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропи-

танную раствором генцианвиолета, капают 2 капли воды и оставляют на 2-3 мин.

2.Фильтровальную бумагу убирают, раствор сливают, добавляют раствор Люголя на 1-2 мин., сливают. Водой не промывают!

3.На 15-30 сек. Наносят на мазок 96 % спирт для обесцвечивания мазка, и

немедленно промывают препарат водой!

4.На мазок наносят фуксин Пфейффера на 1-2 мин., смывают, препарат про-

мывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под им-

мерсией.

Сущность метода окраски по Граму состоит в том, что отношение к крас-

кам зависит от химического состава и структурных особенностей клеточной стен-

ки микробной клетки, в частности наличия муреина (пептидогликана) и частично

25

липидов. Грамположительные бактерии прочно удерживают комплекс краски генцианвиолета с йодом (раствор Люголя). Обработка бактерий спиртом вызывает разбухание муреина и уменьшает диаметр пор клеточной стенки, в результате кра-

ситель оказывается как бы «запертым» и воздействие второго красителя не дает видимых результатов. Поэтому грамположительные микроорганизмы, имеющие большое содержание муреина (до 80 %, трехслойная оболочка, наличие тейхоевых кислот), окрашиваются в фиолетовый цвет.

У грамотрицательных микроорганизмов слой муреина тоньше (10-20 %, од-

нослойная оболочка, нет тейхоевых кислот), поры до конца не смыкаются и спирт свободно проникает сквозь клеточную стенку и обесцвечивает бактерию. Они со-

держат большое количество липидов, которые хорошо растворяются в спирте и способствуют обесцвечиванию микробных клеток, поэтому они окрашиваются в красный цвет (рисунки 16, 17, 18).

Рисунок 16 - Этапы окраски мазка по Граму.

26

обесцвечиваются и воспринимают вторую окраску метиленовым синим (рисунок

19).

Контрольные вопросы:

1.Простые и сложные методы окраски.

2.Описать технику метода окрашивания по Граму.

3.В чем сущность окраски по Циль-Нильсену.

4.Особенность строения клеточной стенки грамположительных и грамотри-

цательных бактерий.

5. Описать основные формы бактерий.

Тема 1.3. Окраска спор, капсул бактерий, методы определения подвижно-

сти бактерий.

Цель занятия: изучить окраску спор и капсул микроорганизмов, изучить по-

движность микроорганизмов, уяснить правила приготовления мазка для обнару-

жения капсулы и методы окраски капсул, уяснить методы окраски спор, уяснить методы для определения подвижности микроорганизмов.

Содержание:

1.Окраска спор, капсул бактерий.

2.Методы определения подвижности бактерий.

Бактериальная спора, эндоспора, (от лат.

Spora - семя, посев) – непостоянный структурный элемент бактериальной клетки, защищающая ее от неблагоприятных воздействий внешней среды (ри-

сунок 20). Споры представляют собой покоящиеся формы прокариот, выдерживающие влияние высо-

кой температуры, ультрафиолетовое облучение, Рисунок 20 - Бактериальная радиации, вакуума, высушивание, действие хими- спора.

ческих дезинфектантов, растворителей, различного рода токсических веществ и других неблагоприятных факторов, приводящих к гибели вегетативные клетки. В

29

природе образование спор помогает клеткам избегать гибели при истощении суб-

страта или высушивании, воздействии радиации или химических веществ. Неко-

торые эндоспоры остаются жизнеспособными в течение 500 лет (например, споры бацилл сибирской язвы в скотомогильниках), споры актиномицетов — до 7 500

лет, но совершенно уникальным является случай проращивания спор

Bacilluscereus, обнаруженных в кишечнике пчелы, найденной в кусочке янтаря,

насчитывающего 25 — 30 млн. лет!

Бактериальные споры (эндоспоры) формируются внутри материнскихвегета-

тивных клеток бактерий в цитоплазме. Спорообразующие бактериипринадлежат к родам Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Sporosarcina, Thermoactinomyces.Все эти микроорганизмы образуют толстую клеточную стенку грамположительного типа, что, по-видимому, является необходимым для спо-

рообразования.

Как правило, в одной бактериальной клетке образуется одна спора, однако известны случаи формирования до пяти спор в одной бактериальной клетке.

Споры могут иметь следующее расположение (рисунок 21):

1.центральное (Bacillus anthracis)

–в центре клетки;

2.терминальное (Clostridium tetani) – на одном из полюсов клетки;

3.субтерминальное (Clostridium chauvoei) - ближе к одному из полюсов клетки.

Процесс спорообразования назы-

вается споруляция.

Под воздействием неблагоприят-